论文部分内容阅读
目的:初步研究组蛋白甲基化转移酶G9a在多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)发病中的作用,为进一步探寻多发性骨髓瘤新的治疗靶点提供理论基础。方法:选取2018年7月至2018年11月天津医科大学总医院血液科初治MM患者32名,12名IDA患者作为正常对照。MASC分选MM患者及正常对照骨髓CD138~+细胞,应用RT-PCR方法检测G9a在初治MM患者、正常对照组骨髓中CD138~+细胞及人骨髓瘤细胞系(OPM-2和U266)中的表达水平。体外培养OPM-2及U266,予不同浓度(0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM)的G9a特异性抑制剂BIX-01294,在不同时间(24h、48h)下采用CCK-8增殖试剂盒检测细胞系增殖情况,采用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测细胞系凋亡情况。应用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)技术检测G9a及其下游作用蛋白即H3K9me2蛋白分子的表达量。结果:1.RT-PCR检测G9a表达水平初治MM患者组G9a的mRNA表达水平较正常对照组明显升高(中位数2.582 vs.0.965,p<0.05),MM细胞系OPM-2、U266中G9a的mRNA表达量也较正常对照组升高(中位数4.180 vs.0.965,3.960 vs.0.965,p<0.05),两者均有统计学意义。初治MM患者CD138~+细胞和OPM-2、U266细胞系中G9a mRNA表达量无明显差异(p>0.05)。2.CCK-8检测细胞增殖情况不同浓度BIX-01294(0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM)作用于OPM-2 24h,细胞活力分别为96.15±2.864%、94.17±3.082%、73.90±1.236%、49.91±3.117%、29.15±1.257%,药物浓度0.625μM、1.25μM组与对照组比较均无统计学差异(p>0.05),药物浓度2.5μM、5μM、10μM组与对照组比较均有统计学差异(p<0.05);作用48h后细胞活力分别为96.26±2.626%、94.94±1.736%、58.68±2.032%、25.88±2.068%、8.316±0.5757%,药物浓度0.625μM、1.25μM组与对照组比较无统计学差异(p>0.05),药物浓度2.5μM、5μM、10μM组与对照组比较均有统计学差异(p<0.05)。比较24h组和48h组,两组2.5μM、5μM、10μM浓度组细胞增殖率分别为73.90±1.236%vs.58.68±2.032%、49.91±3.117%vs.25.88±2.068%、29.15±1.257%vs.8.316±0.5757%,三组比较均p<0.05。在高浓度组随着作用时间延长细胞活力相应减弱,提示BIX-01294作用于OPM-2细胞后,低浓度(0.625μM、1.25μM)对细胞增殖无明显影响,但高浓度(2.5μM、5μM、10μM)作用后细胞活力随着药物浓度增加而减弱,且随作用时间延长而减弱。不同浓度BIX-01294(0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM)作用于U266 24h,细胞活力分别为88.51±8.085%、74.40±3.457%、47.00±1.024%、30.34±1.379%、16.78±1.357%,药物浓度0.625μM组与对照组比较无统计学差异(p>0.05),药物浓度1.25μM、2.5μM、5μM、10μM组与对照组比较均有统计学差异(p<0.05);作用48h后细胞活力分别为89.08±6.911%、78.53±4.249%、26.08±1.566%、20.71±3.154%、8.856±3.230%,药物浓度0.625μM组与对照组比较无统计学差异(p>0.05),药物浓度1.25μM、2.5μM、5μM、10μM的实验组与对照组比较均有统计学差异(p<0.05)。比较24h组和48h组,两组在药物浓度2.5μM、5μM、10μM组细胞活力分别为47.00±1.024%vs.26.08±1.566%、30.34±1.379%vs.20.71±3.154%、16.78±1.357%vs.8.856±3.230%,三组比较均p<0.05。在高浓度组随着作用时间延长细胞活力相应减弱,提示BIX-01294作用于U266细胞后,低浓度(0.625μM)对细胞增殖无明显影响,但高浓度(1.25μM、2.5μM、5μM、10μM)作用后细胞活力随着药物浓度增加而减弱,且随作用时间延长而活力减弱。3.FCM检测细胞凋亡情况不同浓度BIX-01294(0μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM)作用于OPM-2 24h,细胞凋亡率分别为6.507±0.211%、6.873±0.428%、9.967±0.5487%、42.87±1.532%、77.64±0.9978%、85.83±0.7076%,药物浓度0.625μM组与对照组比较无统计学差异(p>0.05),药物浓度1.25μM、2.5μM、5μM、10μM组与对照组比较有统计学差异(p<0.05);作用48h细胞细胞凋亡率分别为5.613±0.5733%、5.697±0.1641%、11.00±0.5774%、48.05±2.488%、85.46±1.082%、90.57±0.3012%,药物浓度0.625μM组与对照组无统计学差异(p>0.05),药物浓度1.25μM、2.5μM、5μM、10μM组与对照组有统计学差异(p<0.05)。提示BIX-01294作用于OPM-2,低浓度(0.625μM)对细胞凋亡无明显影响,但随着浓度递增(1.25μM、2.5μM、5μM、10μM)作用后细胞凋亡随着药物浓度增加而增强。比较24h组和48h组凋亡率在5μM组(77.64±0.9978%vs.85.46±1.082%)和10μM组(85.83±0.7076%vs.90.57±0.3012%),p<0.05,且凋亡率随着作用时间延长细胞凋亡率相应增加。不同浓度BIX-01294(0μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM)作用于U266 24h,细胞凋亡率分别为13.47±0.9400%、17.11±0.6350%、26.62±1.835%、47.57±6.305%、71.81±1.500%、84.43±2.375%,药物浓度0.625μM组与对照组比较无统计学差异(p>0.05),药物浓度1.25μM、2.5μM、5μM、10μM组与对照组有统计学差异(p<0.05);作用48h细胞凋亡率分别为15.39±0.7789%、17.92±0.9357%、23.55±0.8278%、76.21±2.058%、96.06±0.3810%、98.12±0.1563%,0.625μM组与对照组无统计学差异(p>0.05),1.25μM、2.5μM、5μM、10μM组与对照组比较均有统计学差异(p<0.05)。提示BIX-01294作用于U266,低浓度(0.625μM)对细胞凋亡无明显影响,但随着浓度递增(1.25μM、2.5μM、5μM、10μM)作用后细胞凋亡随着药物浓度增加而增强。比较24h组和48h组凋亡率在2.5μM组(47.57±6.305%vs.23.55±0.8278%),5μM组(77.64±0.9978%vs.85.46±1.082%)和10μM组(85.83±0.7076%vs.90.57±0.3012%),p<0.05,且凋亡率随着作用时间延长细胞凋亡率相应增加。4.蛋白免疫印迹检测BIX-01294作用于OPM-2细胞48h对G9a、G9a下游作用蛋白H3K9me2表达量的影响根据上述增殖及凋亡结果选用BIX-01294 0μM、2.5μM作用于OPM-2细胞48h后,Western blot显示实验组(2.5μM)G9a及H3K9me2蛋白的表达量较对照组(0μM)明显减低。结论:1.多发性骨髓瘤患者中G9a表达水平较正常对照组显著升高,骨髓瘤细胞系(OPM-2和U266)中G9a表达水平较正常对照组升高。2.G9a小分子抑制剂BIX-01294在低浓度时对细胞增殖及凋亡无明显影响,随药物浓度升高及作用时间延长细胞增殖受限、凋亡增加,提示细胞增殖抑制率及凋亡率对BIX-01294有浓度及时间依赖性。3.BIX-01294(2.5μM)处理OPM-2细胞48h后可以明显减弱G9a及H3K9me2蛋白的表达。4.G9a在MM中高表达,其特异性抑制剂BIX-01294可通过显著降低H3K9双甲基化水平抑制MM细胞增殖、促进凋亡。初步验证G9a在MM发生、发展中起到一定作用,提示其可能成为MM潜在的治疗靶点。