DNA复制是最基本最重要的生命活动之一。从最简单的单细胞微生物到复杂的高等动植物,所有物种生长繁衍都依赖染色体DNA的精确复制和传递。DNA复制错误和失调将直接导致基因组不稳定,衍生出包括癌症在内的相关疾病或发育异常、生殖缺陷甚至死亡。DNA复制研究不仅具有生物学基础理论意义,而且也在基因组不稳定性引起的重大疾病的医学研究、诊断和治疗中占有重要地位。真核生物DNA复制起始过程中复制机器的组装受到严格调控,与细胞周期进程紧密相连。在细胞周期的G1期,复制解旋酶Mcm2-7以无活性的双六聚体构象(double hexamer,DH)装载到复制原点。当细胞进入S期,Mcm2-7在激酶S-CDK和DDK等的作用下,招募共激活因子Cdc45和GINS,最终双六聚体分离并形成解旋酶全酶Cdc45-Mcm2-7-GINS(CMG)复合体。但MCM双六聚体如何被激活形成两个CMG复合体的具体机制不完全清楚。Mcm10是一个必需的复制因子,之前的研究暗示它在复制解旋酶激活中发挥功能,但具体在解旋酶激活的哪个步骤、发挥怎么样的功能并不清楚,其招募的时间和方式也仍存在争议。本工作以模式生物酿酒酵母为材料,从Mcm10的相互作用出发,希望通过了解Mcm10与解旋酶组分相互作用的机制,进而阐明Mcm10在复制解旋酶激活中的功能。首先,本研究发现Mcm10能与Mcm2-7的多个亚基相互作用。有意思的是,虽然体外生化实验显示Mcm10能直接结合单个Mcm2-7亚基,但体内免疫沉淀显示Mcm10只特异地与染色质上的Mcm2-7结合。由于双六聚体只在染色质上形成,说明Mcm10可能倾向于结合双六聚体构象的Mcm2-7。进一步研究证明Mcm10直接结合于Mcm2/4/6的N端,暗示Mcm10结合于MCM双六聚体的中间界面。并且,研究表明Mcm10的C端是相互作用的主要结构域,去除该区域后引起细胞生长和复制缺陷。此外,我们发现Mcm10-Mcm2-7相互作用受细胞周期调控。随着细胞进入S期,Mcm10N端的第66位丝氨酸(S66)会被CDK磷酸化,并且该磷酸化增强了 Mcm10-Mcm2-7相互作用。进一步研究表明,磷酸化缺失突变mcm10-S66A与Mcm10C端缺失合成致死。而借助GFP-GBP(GFP binding protein)重建突变体蛋白与Mcm2-7的相互作用,则能回补互作缺陷突变体mcm10△C-S66A的生长和DNA复制缺陷。以上结果直接证明Mcm10-DH相互作用对于细胞生长和DNA复制是必需的,且该相互作用受细胞周期及S-CDK磷酸化调控。激酶DDK是Mcm2-7的激活因子,它结合并磷酸化Mcm2/4/6的N端,促进解旋酶激活。我们通过遗传和体内相互作用回复实验,证明Mcm10和DDK存在功能上的关联(crossta1k)。此外,研究证明Mcm10直接结合于DDK以及Mcm2/4/6的N端,表明Mcm10与DDK协同作用促进Mcm2-7的激活。但是进一步研究发现Mcm 10-Mcm2-7相互作用对DDK磷酸化Mcm4,以及CMG复合体亚基的招募没有明显影响,暗示相互作用的功能定位于双六聚体分离过程中。为了观测双六聚体分离过程,我们建立了“体内MCM双六聚体分离检测体系”,并通过该体系证明G1期细胞内的Mcm2-7在染色质上形成双六聚体,随着细胞进入S期逐渐分离,成功实现了对细胞内“MCM双六聚体形成-分离”的追踪。进一步实验表明Mcm10-Mcm2-7互作缺陷突变体存在明显的双六聚体分离延迟,证明Mcm10通过与MCM DH相互作用,促进其变构分离。之前有关解旋酶结构和功能的研究主要依赖体外重建及电镜观察的方法,只能获得相对“静态”的结果。本研究首次捕捉到了内源MCMDH变构分离的“动态”过程,为研究解旋酶激活过程提供了工作基础。更重要的是,本论文系统地研究了 Mcm10与Mcm2-7的相互作用模式及调控,表明Mcm10在DNA复制起始中的必需功能依赖Mcm10-Mcm2-7相互作用,提出了“Mcm10介导MCM双六聚体分离变构”的模型。本工作为经典的DNA双向同步复制模型提供了更清晰更完整的分子机制。