研究背景:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病严重的并发症之一。发生原因复杂及多样,目前公认能预测DN发生及预后的生物学指标——尿微量白蛋白,被认为缺乏更早的预警性及预后缺陷,在DN治疗方面,目前也并无特别有效的对因治疗,特别是到大量尿白蛋白期之后,治疗效果极差,所以期望有简便无创的指标能更早预测DN,以便能更早干预治疗,尿肝型脂肪酶结合蛋白(Liver-type fatty acid binding protein,L-FABP)就是其中之一。在DN患者中随着尿微量白蛋白升高而升高,具有较好的预测性。研究发现它在肾脏氧化应激后分泌增加,在肾损伤修复中占有重要地位,并且发现是Nrf2/ARE通路的下游基因。中药黄芪广泛应用在肾病治疗领域,对于DN,也有诸多研究证实其有肾脏保护作用,体现在抗炎、抗氧化、改善凋亡等多个方面。Nrf2/ARE是氧化应激通路上的重要一环,在这个方面,未有研究涉及黄芪对Nrf2/ARE及其下游基因L-FABP的影响。故设计该研究进一步明确。目的:探索黄芪对2型糖尿病早期肾损害标志物尿L-FABP的影响及在抗氧化应激方面的分子机制,寻找中医药干预DN的治疗靶点。方法:临床研究部分:62例2型糖尿病患者(尿ACR≤300mg/g)。随机分为对照组(30例)和治疗组(32例)。对照组进行西医的基础治疗。治疗组在对照组的治疗上,治疗组加单药黄芪(30g/日)治疗。疗程3周。观察尿L-FABP,尿β2微球蛋白,尿ACR、糖化白蛋白、中医临床症状积分等指标的前后变化。其中以30例健康人尿液样本测定作为尿L-FABP的基线。实验研究部分:将黄芪的主要活性成分——黄芪甲苷作为干预药物,培养人近端肾小管上皮细胞HK-2。分成空白对照组、高糖组(30mmol/l)及黄芪甲苷组(根据细胞毒性试验结果设置浓度组分别为10μM、20μM、40 μM)。应用TUNEL法及流式细胞仪检测细胞增殖及凋亡。Western Blot 明确促凋亡蛋白 Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9 及抑凋亡蛋白Bcl-2的变化。DCFH-DA及ELISA法检测氧化应激指标变化:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化脂质(LPO)的酶活性及ROS含量。最后采用荧光定量PCR检测L-FABP的含量及Nrf2/ARE通路的变化。结果:临床研究部分:尿L-FABP在糖尿病患者中,表达比健康人更高,是更早预测糖尿病肾病发生的生物学标志物,它与血脂中的TG、TC、LDL相关,与尿β2-MG、胱抑素C正相关,与尿β2-MG的相关性最高。在经过降糖降压降脂治疗之后尿L-FABP、尿β2-MG及尿ACR均有显著下降,而加用黄芪治疗,可使尿L-FABP、尿ACR下降更明显。体现了黄芪对糖尿病肾脏损害的保护作用。同时对于气虚证的临床表现,降糖降压降脂治疗均可对此有所改善,加用黄芪后,改善更为明显。实验研究部分:台盼蓝染色结果提示在0-40 μM黄芪甲苷时细胞数量无显著变化,随着黄芪甲苷的浓度增加60-100μM细胞数逐渐减少,细胞毒性增加。故黄芪甲苷的干预浓度确定为0-40 μM。高血糖环境引起HK-2细胞发生明显的凋亡,抑制了细胞增殖。促凋亡基因Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表达量上升,抑凋亡基因Bcl-2表达量下降。并且抑制了一系列抗氧化酶的表达:而ROS表达明显增加。提示高糖环境下,氧化应激反应活动增加。加入黄芪甲苷后,上述反应均有所改善,并且与黄芪甲苷剂量成正相关。高糖抑制了 HK-2细胞中Nrf2在核内的表达,进一步研究发现高糖明显抑制了 Nfr2及Keep1、NQO1及HO-1的mRNA表达,导致L-FABP表达增加。而黄芪甲苷改善了这种情况,并且呈剂量正相关。结论:1尿L-FABP在糖尿病患者中,表达比健康人更高,是更早预测糖尿病肾病发生的生物学标志物,它的表达水平与血脂中的TG、TC、LDL相关,与尿β2-MG、胱抑素C正相关,与尿β2-MG的相关性最高。2单药黄芪可改善2型糖尿病患者较早期的肾损害,使尿L-FABP、尿ACR水平下降。3单药黄芪可改善2型糖尿病早期肾损害患者的气虚证临床表现。4黄芪主要成分——黄芪甲苷可改善高糖引起的HK-2细胞毒性以及氧化应激反应。5黄芪甲苷可能通过调节Nrf2/ARE通路,减少下游基因L-FABP的表达,来改善高糖引起的HK-2细胞毒性及氧化应激,为糖尿病肾病治疗提供一个新靶点。