论文部分内容阅读
胰腺癌高致死率已成为进一步提高远期疗效的瓶颈,临床上迫切需要寻找新的手段以准确预测胰腺癌的早期发生。近几年来人们已经成功证明K-RAS、Palladi、BRCA2等基因突变是胰腺癌的直接原因,这些研究成果在一定程度上解析了部分胰腺癌的发病机制,但仍然缺乏特异性和临床非创伤性检测的可行性。虽然目前也确定了一些高危因素如吸烟、糖尿病、肥胖等,但这些高危因素多是统计流行病学病例-对照、队列研究的结果,US Preventive Services Task Force (USPSTF)仍不推荐对无症状的高危人群进行普查。因此,采用分子流行病手段套索该病的高危易感因素、发病机制和药物作用差异性仍然是胰腺癌研究的重点。胰蛋白酶可通过降解细胞外基质和基底膜参与胰腺癌的侵袭、转移过程,还可以作为一种信号分子激活细胞膜表面受体一蛋白酶激活受体-2(PAR-2)刺激胰腺癌细胞的增殖和黏附,本研究通过对胰蛋白酶原基因(trypsinogen gene, PRSS1)与胰腺癌的遗传易感性的深入探讨,表明胰腺癌遗传易感性具有显著的种族差异,并对目前国际上报道的一些其他基因突变也进行了筛查；同时利用随机引物PCR与电化学传感器联用技术,初步建立用于绘制胰腺癌基因指纹图谱的新方法。目的：1.本研究用PCR产物直接测序的方法初步筛查汉族胰腺癌患者的相关基因突变或多态的存在,初步绘制汉族胰腺癌人群的基因突变图谱；2.在发现汉族胰腺癌相关基因突变的基础上应用SWISS-MODEL软件构建不同突变体的空间构象用于理论解析部分胰腺癌的可能发病机制；3.考察PCR反应底物dGTP在玻碳电极和碳纳米管修饰的玻碳电极表面的电化学行为；4.探讨随机引物PCR与纳米电化学传感器联用的基因指纹图谱方法用于胰腺癌差异基因筛查的可行性。方法：1.检索国内外文献报道的胰腺癌相关基因突变——外周血基因突变(PRSSl基因、Palladin基因、线粒体基因等),根据突变的频率、参考文献的篇数和参考文献影响因子等排出筛查的先后顺序,按参考文献或自行设计的引物序列,对来自汉族人群的154例散发胰腺癌、2例来自一家族聚集性胰腺癌患者和520例健康对照抽提全血DNA后进行PCR扩增,产物纯化后直接测序；2.基于汉族胰腺癌人群的基因突变频率建立分子诊断平台；3.对来自不同的PRSSl基因型患者进行血清胰蛋白酶ELISA检测和相关的实验室和一般临床资料的收集。4.检测不同浓度的dGTP标准品在玻碳电极和碳纳米管修饰玻碳电极上的电化学行为,并向模拟常规PCR反应条件的缓冲体系中添加不同浓度的dGTP标准品,考察模拟体系下电化学行为。5.应用随机引物PCR法扩增正常对照和胰腺癌患者的外周血的DNA样本(同一定量模板情况下),在碳纳米管修饰玻碳电极上检测PCR反应剩余的dGTP量,用以判读PCR产物或模板链的差异性,并对随机引物PCR联合纳米电化学传感器基因指纹图谱应用于胰腺癌差异基因筛查的可行性进行评估。结果：1.共有156例胰腺癌患者进入研究队列,其中9.61%(15/156)汉族胰腺癌患者携带胰蛋白酶原基因突变,主要集中在3、4号外显子和3号内含子,有别于国际上报道80%的PRSSl基因突变发生在R122H和N29I两个位点,PRSSl基因多位点杂合突变是汉族胰腺癌患者的显著分子遗传学特征。2.在一个带有家族聚集性的2例胰腺癌患者中发现胰蛋白酶原基因启动子区双SNPs(-409T/C和-204 A/C),详细比较了这两个SNPs位点在不同种族人群中的基因频率,发现-409 T/C是汉族胰腺癌人群的保护因子(OR=0.1197),而且-409 T/C和-204A/C存在着交互关系。3.线粒体基因3243 A→G突变偶见于散发性胰腺癌患者。4.胰腺癌患者血清胰蛋白酶明显高于健康对照组,而且携带-409 T/C基因型的患者血清胰蛋白酶水平仅为正常体检者的1/2和-409 T/T基因型胰腺癌患者的1/3,同时胰腺癌患者的血清透明质酸和Ⅳ型胶原明显高于正常对照组。5.不同浓度的dGTP在玻碳电极特别是碳纳米管修饰的玻碳电极上表现出良好的电化学氧化行为,利用其氧化峰电流信号可判别浓度差异的线性范围在30～500 umol/L之间,刚好落在临床常规PCR条件下的底物浓度。6.随机引物PCR与纳米电化学传感器基因指纹差异检测PCR反应底物(dGTP)的变化情况可以用于初步筛查胰腺癌的差异基因。结论：1.汉族胰腺癌患者与国际上报道的基因易感性存在着遗传异质性,胰蛋白酶原基因的杂合性突变是其主要特征。2.随机引物PCR与纳米电化学传感器联用技术可以用于初步区分不同的DNA指纹图谱。6