目的：研究表明，脊髓神经胶质细胞的激活在病理性疼痛的发生、发展和维持过程中发挥重要的作用。活化的神经胶质细胞释放的促炎物质，如白介素、肿瘤坏死因子等，可以增强神经元的兴奋性，提高疼痛敏感性。早期给予米诺环素，四环素类药物等神经胶质细胞抑制剂可以抑制神经炎症的发生，阻止星形胶质细胞和小胶质细胞的激活。但在病理性疼痛发生发展的过程中，脊髓神经胶质细胞的激活及其作用机制尚不完全清楚。兴奋性氨基酸及其受体，特别是N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid, NMDA）及其受体在脊髓伤害性信息传递过程中发挥重要的作用。NMDA受体是中枢神经系统中兴奋性氨基酸受体的一种亚型，属于离子型受体，广泛存在于中枢神经系统中。脊髓中兴奋性氨基酸及其NMDA受体的异常活动可导致脊髓的中枢敏化，参与自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏的形成。研究提示，NMDA受体参与神经病理性疼痛模型中脊髓后角胶质细胞的激活。但外周炎性痛过程中脊髓后角胶质细胞激活的机制尚不清楚。我室既往应用免疫印迹分析技术和免疫组化技术发现，给大鼠足底注射蜜蜂毒使大鼠发生伤害性感受的同时，脊髓后角星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白（glial fibrilary acidic protein,GFAP）和小胶质细胞标记物CD11b/c（OX-42）蛋白表达增加。预先椎管内注射NMDA受体阻断剂MK-801可以抑制蜜蜂毒引起的GFAP和CD11b表达的上调。这些结果初步提示NMDA受体的激活是介导炎性痛及痛过敏过程中脊髓后角星形胶质细胞和小胶质细胞激活的原因之一。本课题在此基础上，采用免疫印迹分析（western blot）技术，进一步观察大鼠鞘内注射NMDA受体特异性激动剂NMDA对GFAP和CD11b两种蛋白表达的影响，为阐明NMDA受体激活在伤害性信息传入引起的脊髓后角胶质细胞激活中的作用提供进一步的实验依据。方法：雄性Sprague-Dawley大鼠120只，体重210-220g，随机分为以下各组：①sham组：椎管内注射生理盐水10μl。于相应时间点取材观察。②NMDA时间依赖组：鞘内注射NMDA溶液10μl（10nmol）分别于椎管内注射后1h、4h、8h、12h、1d、2d、3d取材，观察腰5节段脊髓后角GFAP和CD11b蛋白表达的时间特点。取材之前测定机械刺激缩足阈值、热辐射缩足潜伏期和热甩尾潜伏期。对比分析GFAP和CD11b的表达与痛觉过敏的时间对应关系。③NMDA剂量依赖组：鞘内注射NMDA溶液10μl。根据NMDA的注射剂量，进一步分为0.1nmol、1nmol和10nmol三个亚组。各组动物在鞘内注射之后8h取材，观察NMDA上调大鼠腰5节段脊髓后角GFAP和CD11b蛋白表达的剂量依赖性。取材之前测定机械刺激缩足阈值、热辐射缩足潜伏期和热甩尾潜伏期。对比分析GFAP和CD11b的表达与痛觉过敏的剂量对应关系。④MK-801+NMDA组：首先鞘内注射NMDA受体抑制剂MK-801生理盐水溶液10μl（50nmol），15min后鞘内注射NMDA溶液10μl（10nmol）。在注射NMDA之后8h取材，观察MK-801对NMDA引起的腰5节段脊髓后角GFAP和CD11b蛋白表达上调的影响。取材之前测定机械刺激缩足阈值、热辐射缩足潜伏期和热甩尾潜伏期。对比分析预先给予MK-801大鼠GFAP和CD11b的表达与痛觉过敏的对应关系。以上各组动物在预定时间点取材，应用western blot方法测定其脊髓后角GFAP和CD11b的表达，以反映脊髓后角星形胶质细胞和小胶质细胞的激活状态。每组10只大鼠，其中5只用于GFAP的测定，5只用于CD11b的测定。数据用均数±标准差（x±s）表示。采用社会科学统计程序（StatisticalProgram for Social Sciences13.0）进行单因素方差分析（One-WayANOVA），比较组间差异，有显著差异者用最小显著差法（least significantdifference）进行两两比较，以p<0.05作为判断差异显著性的标准。结果：1痛行为反应1.1自发痛行为反应椎管内注射NMDA以后大鼠出现了特征性的伤害性行为反应，包括一些紧张性的咬、抓、舔、吱叫和扭体等。随着时间的延长，这种痛行为反应逐渐消失。预先给予NMDA受体抑制剂MK-801可以减轻大鼠出现的上述反应。1.2机械缩足反射阈值大鼠椎管内注射NMDA10nmol以后4h，大鼠的机械缩足反射阈值开始出现降低（P<0.05），并持续到给予NMDA后1d，2d时逐渐恢复至sham组水平，表明椎管内注射NMDA后早期就已经出现机械痛觉过敏，而且这种痛觉过敏可持续一定的时间。上述椎管内注射NMDA引起的痛觉过敏呈现一定的剂量依赖性，表现为随着NMDA剂量的增大，机械缩足反射阈值逐渐减小。鞘内预先给予MK-801可以在一定程度上阻断NMDA引起的机械缩足反射阈值的减小。1.3热辐射缩足和热甩尾潜伏期大鼠椎管内注射NMDA10nmol以后1h，大鼠的热辐射缩足和热甩尾潜伏期开始缩短（P<0.05），并持续到椎管内给予NMDA后12d，1d时逐渐恢复至sham水平，表明椎管内注射NMDA后早期就已经出现热痛觉过敏，而且这种热痛觉过敏可持续一定的时间。上述椎管内注射NMDA引起的痛觉过敏呈现一定的剂量依赖性，表现为随着NMDA注射剂量的增大，热辐射缩足和热甩尾潜伏期逐渐缩短。鞘内预先给予MK-801可以在一定程度上阻断NMDA引起的热辐射缩足和热甩尾潜伏期的缩短。2脊髓后角GFAP的表达椎管内注射NMDA溶液10μl（10nmol）后1h，脊髓后角GFAP的表达与sham组相比开始增加（P<0.05），8h达到高峰，随后逐渐下调，至3d时基本恢复到sham组水平。上述GFAP表达上调的时间过程与椎管内注射NMDA后痛行为表现的时间特征基本一致。随着大鼠椎管内给予NMDA剂量的增加（0.1nmol，1nmol和10nmol），脊髓后角GFAP的表达也逐渐升高，表现出明显的剂量依赖性。预先椎管内给予NMDA受体阻滞剂MK-801可明显抑制上述NMDA引起的GFAP表达的上调（P<0.05）。3脊髓后角CD11b的表达与sham组相比，大鼠椎管内注射NMDA溶液10μl（10nmol）后1h，脊髓后角CD11b的表达开始上调（P<0.05），4h逐渐增多，至8h达到高峰，随后表达量逐渐下调，至3d时基本恢复到sham组水平。随着大鼠椎管内给予NMDA剂量的增加（0.1nmol，1nmol和10nmol），脊髓后角CD11b的表达也逐渐升高，表现出明显的剂量依赖性。预先椎管内给予NMDA受体阻滞剂MK-801可明显抑制上述NMDA引起的CD11b表达的上调（P<0.05）。结论：1大鼠椎管内注射NMDA受体特异性激动剂NMDA可以剂量依赖性地上调脊髓后角GFAP和CD11b蛋白的表达，GFAP和CD11b表达上调的时间特点与椎管内注射NMDA引起的痛行为反应时间特点基本一致。2NMDA受体非竞争性抑制剂MK-801可以明显抑制NMDA引起的脊髓后角GFAP和CD11b蛋白的表达。3以上结果提示，NMDA受体的激活是伤害性信息传入引起脊髓后角星形胶质细胞和小胶质细胞激活的原因之一。