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涎腺腺样囊性癌(Salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是涎腺常见的恶性肿瘤,发病率约占所有涎腺恶性肿瘤的22%,发生在舌下腺的恶性肿瘤多为腺样囊性癌。嗜神经侵袭(Perineural invasion,PNI)是SACC最显著的生物学特征,被认为与SACC的局部复发和不良预后相关。然而,由于学者们对PNI现象发病机制认识不足,尚无有效治疗方法。自主神经系统对于维持机体正常生理功能具有重要的调控作用。近期研究提示自主神经及其神经递质可能与前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌等恶性肿瘤的进展相关。目前,除了本人在硕士论文中对SACC组织交感神经分布做过初步研究之外,国内外尚无其他关于自主神经在SACC中分布及与PNI关系的报告。鉴于涎腺丰富的自主神经分布和自主神经在肿瘤进展中重要的调控作用,本论文拟通过研究SACC组织中自主神经、神经递质及相应受体的分布并分析其与PNI的相关性,通过体外和体内实验观察自主神经递质对SACC细胞系PNI的影响并初步探索可能的机制。本研究有助于阐明SACC PNI的发病机制,同时也为治疗PNI提供可能的实验基础。自主神经系统由交感神经和副交感神经组成,故本论文分别研究交感神经和副交感神经促进SACC PNI的作用及其机制。第一部分:交感神经促进SACC嗜神经侵袭及其机制研究目的:1)观察交感神经、β2肾上腺素能受体(β2-adrenergic receptor,β2-AR)和交感神经递质去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)在SACC组织的分布并分析其与PNI的相关性;明确NE在背根神经节(Dorsal root ganglia,DRG)PNI模型培养上清液的表达;2)研究β2-AR在SACC-83和SACC-LM细胞系的表达;分析NE对SACC-83和SACC-LM细胞系PNI等恶性生物学行为的影响和阻断β2-AR或α-AR对SACC细胞系PNI的干预;3)阐明NE/β2-AR影响SACC-83和SACC-LM细胞系PNI的下游机制。方法:1)通过免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)方法观察临床SACC组织和正常涎腺组织(Normal salivary gland,NSG)中交感神经和β2-AR的分布,并分析其与PNI等临床病理特征的相关性;通过酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析SACC组织、NSG组织和大鼠仔鼠DRG PNI模型培养上清液中NE的含量,并分析其与PNI的相关性;2)通过实时定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和免疫荧光染色方法观察SACC-83和SACC-LM细胞系α和β肾上腺素能受体表达;通过细胞划痕实验和DRG PNI模型观察NE对SACC-83和SACC-LM细胞系迁移和PNI的影响;通过使用β2-AR特异性阻断剂ICI118,551、siRNA转染阻断β2-AR和非选择性α-AR阻断剂Phentolamine,观察抑制β2-AR或α-AR后对SACC-83和SACC-LM细胞系PNI的干预;3)通过qRT-PCR和Western blot实验检测NE和ICI118,551处理或β2-AR siRNA转染后SACC-83和SACC-LM细胞系上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关分子和基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)的表达,探讨NE/β2-AR影响SACC-83和SACC-LM细胞系PNI的可能机制;结果:1)交感神经在PNI SACC组织中分布多于无PNI SACC组织(P<0.05)和NSG组织(P<0.01);统计分析结果表明:交感神经分布与PNI(P=0.035)和远处转移(P=0.010)显著相关;交感神经分布与PNI的相关性被Logistic回归单因素分析(P=0.002)和多因素分析(P=0.042)进一步证实;β2-AR在PNI SACC组织中表达强于无PNI组织(P>0.05)和NSG组织(P<0.05);统计分析结果表明:β2-AR表达与PNI(P=0.003)和TNM分期(P=0.035)显著相关;β2-AR表达与PNI的相关性被Logistic回归单因素分析(P=0.004)和多因素分析(P=0.076)进一步证实;NE在PNI SACC组织中的含量高于无PNI SACC组织(P<0.01)和NSG组织(P<0.001),NE含量在SACC细胞系与DRG共培养PNI模型上清液增高;2)SACC-83和SACC-LM细胞系中β2-AR表达量最高;NE能够促进SACC-83和SACC-LM细胞系迁移和PNI,非选择性α-AR阻断剂Phentolamine并不能明显抑制SACC-83和SACC-LM细胞系迁移和PNI,而通过特异性阻断剂ICI118,551或siRNA转染下调β2-AR表达能够抑制NE对SACC-83和SACC-LM细胞系迁移和PNI的促进作用;3)NE可能通过诱导EMT和上调MMP表达促进SACC-83和SACC-LM细胞系PNI,阻断β2-AR能够逆转NE对SACC细胞系EMT的诱导和PNI的促进作用。结论:1)交感神经、NE及β2-AR广泛分布于SACC组织,且其分布与SACC PNI相关;2)SACC-83和SACC-LM细胞系能够分泌NE和表达β2-AR;3)NE促进SACC-83和SACC-LM细胞系PNI,阻断β2-AR能够抑制NE的促PNI作用;4)NE/β2-AR可能通过诱导EMT和上调MMP表达而促进SACC细胞系PNI。第二部分:副交感神经促进涎腺腺样囊性癌嗜神经侵袭及其机制研究目的:1)研究副交感神经、M3毒蕈碱受体(M3 muscarinic receptor,M3R)和副交感神经递质乙酰胆碱(Acetycholine,ACh)在SACC组织的分布及与PNI的相关性;研究ACh在DRG PNI模型培养上清液的表达;2)观察M3R在SACC-83和SACC-LM细胞系的表达;研究ACh对SACC-83和SACC-LM细胞系PNI等恶性生物学行为的影响和阻断M3R对SACC-83和SACC-LM细胞系PNI的干预;3)研究阻断M3R对SACC-LM细胞系裸鼠体内PNI的影响;4)阐明ACh/M3R影响SACC-83和SACC-LM细胞系PNI的可能机制。方法:1)通过IHC方法观察临床SACC组织和NSG组织中副交感神经和M3R的分布,并分析其与PNI等临床病理特征的相关性;通过ELISA实验检测SACC组织、NSG组织和大鼠仔鼠DRG PNI模型上清液中的ACh含量,并分析其与PNI的相关性;2)通过qRT-PCR和免疫荧光染色方法检测SACC-83和SACC-LM细胞系M1R-M5R及胆碱乙酰转移酶(Choline acetyltransferase,CHAT)表达;MTT增殖实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验、Transwell PNI模型和DRG PNI模型观察ACh对SACC-83和SACC-LM细胞系增殖、迁移、侵袭和PNI的影响;通过使用M3R特异性阻断剂达非那新(Darifenacin,DAR)和siRNA转染阻断M3R,观察抑制M3R表达对SACC-83和SACC-LM细胞系PNI的干预;3)通过腹腔注射DAR观察其对SACC-LM细胞系裸鼠体内增殖、肺转移和PNI的影响;4)通过Western blot实验检测ACh和DAR处理或M3R siRNA转染后SACC-83和SACC-LM细胞系p-ERK、p-GSK3β、EMT相关分子和MMP的表达,探讨ACh/M3R促进SACC-83和SACC-LM细胞系PNI的可能机制;结果:1)副交感神经在PNI SACC组织中分布多于无PNI SACC组织(P>0.05)和NSG组织(P<0.001);副交感神经分布与PNI(P=0.011)、原发部位(P=0.024)和局部复发(P=0.018)显著相关;副交感神经分布与PNI的相关性被Logistic回归单因素分析进一步证实(P=0.015);M3R在PNI SACC组织中分布多于无PNI组织(P>0.05)和NSG组织(P<0.001);M3R分布与SACC PNI(P=0.019)显著相关;M3R分布与PNI的相关性被Logistic回归单因素分析进一步(P=0.022)证实;ACh含量在PNI SACC组织中高于无PNI SACC组织(P>0.05)和NSG组织(P<0.001),ACh含量在SACC细胞系与DRG共培养PNI模型上清液增高;2)SACC-83和SACC-LM细胞系中M3R表达量最高,还表达有CHAT;ACh能够促进SACC-83和SACC-LM细胞系的增殖、迁移、侵袭和PNI,而通过特异性阻断剂DAR或siRNA转染下调M3R表达能够抑制ACh对SACC细胞系增殖、迁移、侵袭和PNI的促进作用;3)体内实验发现,DAR组裸鼠移植瘤重量较对照组裸鼠移植瘤重量轻(P<0.05);DAR组裸鼠SACC-LM细胞系肺转移率较对照组裸鼠低(P=0.248);DAR组裸鼠较对照组裸鼠出现左后肢功能障碍的时间更晚、PNI率更低(P=0.039)、坐骨神经分数(P<0.001)和坐骨神经指数更高(P>0.05);4)Western blot实验表明,ACh/M3R可能通过激活p-ERK/p-GSK3β信号通路诱导SACC-83和SACC-LM细胞系EMT和MMP表达升高,进而促进SACC细胞系PNI。结论:1)副交感神经、ACh及M3R广泛分布于SACC组织,且其分布与SACC PNI相关;2)SACC-83和SACC-LM细胞系表达M3R和CHAT,并且能够分泌ACh;3)ACh促进SACC-83和SACC-LM细胞系PNI,阻断M3R能够抑制ACh的促PNI作用;4)阻断M3R抑制SACC-LM细胞系裸鼠体内增殖、肺转移和PNI;5)ACh/M3R可能通过激活p-ERK/p-GSK3β信号通路诱导SACC-83和SACC-LM细胞系EMT和上调MMP表达,进而促进SACC细胞系PNI。综上所述,本论文在前期研究的基础上,进一步探索自主神经、神经递质及相应受体在SACC组织的分布及与PNI的关系。本论文研究结果提示自主神经可能对SACC PNI等恶性生物学行为具有促进作用,而阻断自主神经递质相应受体可以通过逆转EMT和下调MMP表达而抑制SACC PNI。本研究有助于阐明自主神经影响PNI的机制,为治疗SACC PNI提供了可能的实验基础和分子靶点。SACC PNI常见临床症状为疼痛、舌麻木和面瘫等,这提示我们SACC可能侵犯感觉神经和运动神经,感觉神经创伤后释放P物质与痛觉的传递有关,运动神经通过释放神经递质乙酰胆碱支配肌肉的运动,鉴于运动神经与副交感神经的神经递质均为乙酰胆碱,二者对肿瘤生物学行为的影响可能会有协同作用。有关感觉神经或运动神经对SACC PNI影响的研究本课题组正在进行,以进一步明确和完善SACC PNI过程中神经的调控作用。