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背景：耐多药结核病(Multi-drug resistant tuberculosis, MDR-TB)是指结核病患者感染的结核分枝杆菌至少同时耐异烟肼和利福平,MDR-TB流行是当前全球结核病控制领域的重大挑战, WHO 2012年报告统计,中亚和东欧的结核高负担国有9-32%的新发结核病例为MDR-TB,50%复治结核病例为MDR-TB。全球107个国家统计显示平均治愈率仅48%,而2015年目标治愈率要达75%以上。常规的二线化疗药物治疗MDR-TB治愈率低和复发率高是当今全球结核病疫情控制的难点,究其深层原因与免疫系统功能异常有关。结核病的发生是结核病原体在宿主体内持续作用与宿主自身免疫反应相互作用的结局。结核感染过程中,有效的细胞免疫反应(cell-mediated immunity responses, CMI)对于清除宿主体内的结核分支杆菌病原体至关重要,而无效的CMI则导致结核菌扩散以及持续的组织病理性损伤。活化的CD4+T细胞,已被公认为是有效抗结核分枝杆菌感染的特异性细胞免疫应答的关键。初始CD4+T细胞可分化为包括Thelper (Th) 1细胞、Th2细胞和调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)亚群,Th17细胞为新鉴定的一种T辅助细胞亚群,通过效应性细胞因子素白介素(interleukin, IL)-17、诱导相关炎症因子和与其他效应T细胞相互作用发挥免疫效应。已发现Th17细胞介导的免疫应答,在机体对抗特定抗原的免疫调控和免疫防御过程中占主导地位。在结核分枝杆菌感染早期检测到IL-17表达,IL-17能强有力地增强CMI,提示机体适应性激发Th17应答来对抗那些不能被Thl和Th2型免疫有效清除的病原体。国外仅对于Th17细胞在一般结核分枝杆菌感染过程中的变化有少量文献报道,对于Th17细胞在MDR-TB发病中的作用和地位尚未见研究报道。IL-2是在CMI中起中心作用的细胞因子,可使已激活的效应T细胞进一步增殖分化,促进其分泌r干扰素(interferon-γ,IFN-γ),增强杀伤结核杆菌的能力。已有研究发现低剂量重组人白介素-2(recombinant human interleukin-2,rhIL-2)与抗结核化学药物联合应用于结核治疗MDR-TB患者,增加了抗结核治疗的反应性,而且减少了痰中结核菌负荷量,痰菌阴转率和阴转速度均有提高。分子水平研究发现低剂量rhIL-2的使用能促进IFN-γ mRNA和il-2 mRNA表达,提示低剂量rhIL-2进入机体能够激活CMI。迄今,国内外鲜有关于rhIL-2联合标准抗结核化疗药的方案用于MDR-TB患者治疗的大规模临床研究,具体机制也尚不明确。本课题以MDR-TB患者为立足点,针对"rhIL-2免疫辅助治疗的疗效”、 “Th17在免疫调控中的作用’”以及"rhIL-2治疗对Th17免疫调控的影响”这三方面分三部分研究,旨在阐明MDR-TB感染的免疫调控机制,以探索减弱病理损伤性免疫通路而强化保护性免疫通路的适应性免疫调节机制为主线来寻找有效的免疫疗法,作为提高难治性及耐药性结核病治愈率的一个有力途径。第一部分重组人白介素-2免疫辅助治疗对耐多药肺结核病患者的临床疗效方法：通过前瞻性、随机、对照研究方法观察rhIL-2免疫辅助治疗MDR-TB患者的疗效,对照组51例采用标准抗耐多药结核化疗方案,总疗程24月；治疗组50例采用对照组方案+rhIL-2辅助治疗,总疗程18月,rhIL-2皮下注射给药疗程至第8个月末。随访监测两组病例在疗程各月末的细菌学、影像学指标好转率。结果：疗程末治疗组治疗失败例数、死亡例数、丢失例数均低于对照组。治疗组治愈率53%显著高于治疗组治愈率25%(P=0.02)。疗程末18个月rhIL-2辅助治疗组比24个月标准化抗耐多药结核治疗组治愈率显著提高了28%,缩短疗程至少6个月。结论：采用rhIL-2免疫辅助标准化疗方案提高MDR-TB患者治愈率20%以上,缩短疗程至少6月,有望成为耐多药肺结核治疗的有效疗法。第二部分Th17在耐多患肺结核病·者免疫调控中的作用方法：采用流式细胞技术和流式微球技术(Cytometric Bead Array,CBA),从细胞水平和蛋白水平观察25例对照组MDR-TB患者化疗前和化疗后Th17细胞和Treg细胞,Th1细胞及其相关细胞因子在外周血表达的动态变化,并以健康志愿者及DS-TB患者为对照做统计分析.结果: MDR-TB患者在治疗前与DS-TB患者和健康志愿者相比,外周血Th17比例升高(3.28±0.55)%(p<0.01),相关细胞Treg比例升高(p<0.01),Thl比例降低(p<0.01)。外周血上清液IL-17,IL-4、IL-6浓度升高(p<0.05),IFN-γ浓度降低(p<0.05)。与治疗前相比MDR-TB患者治疗12月后Th17细胞比例逐渐降低(p<0.05),Thl细胞比例升高(p<0.01)达健康者水平(p>0.05),IL-17,IL-6,IL-4浓度降低(p<0.05),IFN-γ浓度升高(p<0.05)。IL-6和IL-17在MDR-TB患者疗程中表达正相关(p<0.05,r=0.25(0.20-0.31))。治疗12月末病灶显效吸收的患者Th17细胞比例显著低于影像学无改善的患者(p<0.01)。结论：耐多药结核菌感染过程中Thl7免疫应答激活,介导促炎症效应为受损的Thl应答功能发挥抗结核感染免疫应答补充替代的作用。Th17/Th1免疫应答平衡的恢复与病灶吸收好转有关。第三部分重组人白介素-2治疗对耐多药肺结核病患者Th17免疫调控的影响方法：采用流式细胞技术和实时荧光定量PCR(real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR)技术从细胞水平和基因水平观察23例治疗组MDR-TB患者rhIL-2免疫治疗前后Th17细胞,Treg,Th1细胞以及IL-17mRNA,FoxP3mRNA, ROR-γt mRNA,IFN-γmRNA在PBMCs中动态表达,并以25例对照组患者同期表达水平为对照做统计分析。结果：治疗6月末及12月末23例治疗组患者外周血Th17细胞和Treg细胞表达均逐步降低,并显著低于同期对照组患者(p<0.05),而IL-17AmRNA.ROR-γt mRNA及Foxp3 mRNA在外周循环表达的降低在治疗组患者中也更为显著(p<0.05)。治疗组Thl细胞表达逐步升高,治疗12月末显著高于同期对照组患者(p<0.01)。对照组患者和治疗组患者外周血Th17/Treg比值均表现为逐步降低, 治疗6月末及12月末Th17/Treg比值在两组间均无明显差异。结论：采用rhIL-2免疫治疗能显著减弱Th17细胞在MDR-TB感染中过度激活的免疫促炎症效应,强化Thl介导免疫保护性效应。Th17细胞可能通过Th17/Thl的平衡调控路径和Th17/Treg的平衡调控路径,参与MDR-TB患者保护性CMI机制和病理损伤性CMI机制间的平衡调控。总结：rhIL-2免疫辅助治疗能提高MDR-TB患者化疗的疗效,Th17细胞及其相关效应因子对于MDR-TB患者的临床疗效和愈后有潜在免疫指示作用,为MDR-TB患者的免疫治疗提供研究线索和理论依据,其参与免疫调控网络的机制还需通过进一步研究阐明。