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目的:探究乙醇对的人角膜基质细胞的影响,以及胸腺肽β4(Thymosinβ4,Tβ4)在角膜基质损伤愈合的过程中所发挥的保护作用,并探究其相关作用机制。方法:本实验所采用的实验对象为人角膜基质细胞以及BALB/c小鼠。1.体外实验:选取传代2~4代处于对数生长期的人角膜基质细胞,按实验设计将细胞分为以下4组:正常对照组(control,Ctrl),Tβ4组(T),乙醇组(ethanol,E),乙醇+Tβ4组(E+T)。采用CCK-8细胞增殖与毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测细胞活性。应用2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(2’,7’-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)探针检测细胞的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitive polymerase chain reaction,RT-q PCR)技术检测细胞中氧化应激相关基因:过氧化氢酶(Catalase)以及铜锌超氧化物歧化酶(Cu Zn SOD)的表达量。采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记测定法(Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling,TUNEL)检测细胞凋亡率。RT-q PCR检测细胞中凋亡相关蛋白:半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)以及B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表达水平。酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)检测Caspase-3的表达水平。采用伤口愈合实验检测各组细胞的迁移增殖能力。RT-q PCR检测各组细胞mi R-21的表达水平。采用蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测各组细胞程序性细胞死亡蛋白4(Programmed cell death protein4,PDCD4)的表达。2.体内实验:BALB/c小鼠按实验设计分为以下4组:正常对照(Ctrl)组,Tβ4(T)组,乙醇(E)组,乙醇+Tβ4(E+T)组。采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色法观察小鼠角膜基质层的病理改变。采用免疫荧光染色检测各组小鼠角膜基质中Ki-67(proliferation marker protein Ki-67,Ki67)的表达情况。采用RT-q PCR检测Caspase3以及Bcl-2的相对表达量。采用RT-q PCR检测mi R-21的表达水平。采用免疫荧光染色检测PDCD4的表达水平。结果:(1)细胞水平结果如下。选用体积分数15%乙醇及1μg/ml Tβ4进行后续细胞处理。E组人角膜基质细胞的细胞活力较Ctrl组明显下降,而E+T组细胞与乙醇组相较又有明显提升,差异均具有统计学意义(P<0.01)。E组细胞内活性氧水平较Ctrl组显著提高,而E+T组细胞活性氧水平较E组则明显下降,差异均有统计学意义(P<0.01)。与Ctrl组相比,E组细胞中Catalase以及Cu Zn SOD的表达量下降,而E+T组细胞中以上两种基因表达量较E组有显著提高,差异具有统计学意义(P<0.01)。E组细胞凋亡率较Ctrl组明显升高,E+T组的细胞凋亡率较E组有所下降,差异有统计学意义(P<0.01)。RT-q PCR结果显示,E组细胞内Caspase-3表达量显著提高,但Bcl-2的表达量下降,但在E+T组细胞中Caspase-3表达量下降,但Bcl-2的表达量升高,差异有统计学意义(P<0.01)。E组细胞内Caspase-3蛋白水平结果与RT-q PCR结果吻合。E组细胞迁移率较正常细胞显著减慢,E+T组细胞迁移率较E组有显著提高,差异有统计学意义(P<0.01)。E组细胞内mi R-21的表达量较Ctrl组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。PDCD4为mi R-21下游靶基因,E组细胞内PDCD4的表达量较Ctrl组下降。(2)动物水平实验结果如下。E+T组小鼠角膜愈合速度较E组有显著提高,差异有统计学意义(P<0.01)。E组小鼠角膜基质组织中Ki67表达下降,而E+T组小鼠角膜基质组织中Ki67表达升高,差异有统计学意义(P<0.01)。在小鼠角膜组织中,Caspase-3以及Bcl-2的表达趋势与细胞水平的表达趋势相一致,差异有显著统计学意义(P<0.01)。在小鼠角膜组织中,mi R-21的表达趋势与细胞水平的表达趋势相一致,差异有统计学意义(P<0.01)。免疫荧光染色结果也证实,在小鼠角膜基质中,PDCD4表达趋势与细胞水平的表达趋势相一致。结论:乙醇可诱导人角膜基质细胞发生氧化应激损伤、继发性细胞凋亡,而Tβ4可有效抑制氧化应激损伤、细胞凋亡。乙醇导致小鼠角膜基质损伤、水肿,而Tβ4可促进小鼠角膜修复。除此之外,乙醇可诱导人角膜基质细胞及小鼠角膜基质中mi R-21的表达上调。