研究背景骨质疏松症是一种多因素疾病,具有明显的性别倾向,女性发病率约为男性的6-8倍,是威胁老年人群健康的常见疾病之一,主要病理表现为单位骨量减少,骨组织微结构退变,最终致骨质强度降低,其早期可无明显临床症状,进展期和晚期可出现出局部或全身性慢性疼痛,并可继发如脊柱压缩性骨折,股骨颈、粗隆部、手腕部、肱骨近段骨折风险增加,严重威胁老年人群健康及生活质量。骨质疏松症发病隐匿、进展缓慢性,当表现临床症状时已进展到晚期,所以早期诊断、和预防尤为重要。骨质疏松症直接或间接病因:包括家族遗传因素、创伤因素、内分泌疾病、神经系统疾病、免疫系统疾病、外部创伤等,但老龄化生理退化及内分泌激素调节失衡是骨质疏松症治疗中难以逾越的难题。目前对于骨质疏松症的治疗方案选择主要是以药物控制、饮食调节为主,具有个体差异性,最终的治疗都是以增加单位骨量为目的,而对症处理中钙剂或矿物盐摄入,可缓解疾病的所带来的局部或全身疼痛等临床不适,但并未有效的阻止骨质疏松的进一步进展。目前的药物治疗方案,时间周期长、花费较大、疗效不明确且有不同程度毒副作用,加重了老年人群其他内科疾病。因此许多学者和医务工作者都在致力于寻找新型解决方案,阻止骨质疏松进程发展、改善临床症状及减轻相关并发症,提高老年人群的生活质量。近些年随着骨组织工程研究的深入,干细胞移植相关研究取得良好的成果,已经应用于临床一些疾病的治疗,并取得不错的疗效,例如创伤的骨缺损、神经系统修复、软组织缺损、心血管疾病等广泛运用。随着骨组织细胞活动及代谢基础研究方面不断取得新的突破,已经发现多种对骨代谢活动调节的相关因子如胰岛素样生长B因子(IGF-B)、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF-B)、降钙素基因相关肽(CGRP)等。近年来研究已经证实,骨的代谢活动受骨组织骨中的神经系统能调控,与骨质疏松症的发生密切相关。同时免疫细胞化学研究也证实骨膜、骨皮质、骨小梁、骨髓中存在感觉和自主神经纤维,传递各种神经生物因子(如神经肽、儿茶酚胺和神经营养因子),在骨代谢的调控中扮演重要的角色。降钙素基因相关肽对成骨、破骨细胞活动均有影响,能促进骨的形成和抑制骨的吸收,将CGRP基因移植到小鼠后,可发现成骨细胞中CGRP过表达,骨小梁密度增加,骨质疏松明显缓解,骨质疏松症的基因治疗也逐渐得到广大学者的认可。目前对骨质疏松治疗研究主要集中在新型药物研发、细胞及基因水平治疗研究、各种类型引发骨质疏松症模型的建立及疾病预防,这也为骨质疏松症研究奠定技术基础。CGRP基因疗法促进成骨细胞中CGRP过表达,从而预防性治疗卵巢切除的大鼠发生骨质疏松症,通过促进骨形成和抑制骨吸收来调控骨代谢及影响骨组织的表型。NGF是骨代谢中另一重要的递质及调节因子,成骨细胞能自发分泌NGF,诱导成骨细胞的自身磷酸化反应,调节骨代谢平衡,有利于成骨活动。NGF还可诱发骨的营养代谢活动,提高骨的修复率,骨折修复后的骨痂生物机械强度,并可刺激感觉神经再生及其周围的类骨样组织的形成。目前研究证实,CGRP基因疗法和NGF在骨质疏松症治疗均表现不同潜力。在骨质疏松动物模型中,CGRP基因治疗方案与NGF的联合应用方面的研究少有报道。转CGRP基因骨髓MSC是联合NGF的应用时,CGRP表达方面影响如何,治疗效果是否可获得累计效应、尚无报道。研究目的1.评价外源性(NGF)联合CGRP转基因骨髓干细胞移植治疗骨质疏松大鼠疗效;2.探究外源性NGF对转CGRP的基因的干细胞移植治疗中,CGRPmRNA及蛋白表达水平的影响。研究方法1.骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外分离、纯化、及培养。选取6只4周龄雌性SD大鼠,获取双下肢长骨骨骨髓组织标本,进行体外分离、纯化、传代培养,获得适量的骨髓MSCs细胞。2.构建CGRP基因表达载体。以实验同源SD大鼠基因组为模板,PCR扩增CGRP基因的编码序列,进行pBaBb-puro-CGRP真核表达载体构建。3.转染MSCs及制备稳定的转基因CGRP-MSCs细胞系。将已构建pBaBb-puro真核表达载体,用293FT(人胚肾)细胞系增殖后,反转录(Retrovirus)转染至骨髓间充质干细胞中,待细胞增值融合时,病毒进行感染,进一步筛选,获得稳定CGRP转基因骨髓间充质干细胞系(CGRP-BMSCs),扩增、培养。4.建立骨质疏松大鼠实验动物模型。使用维甲酸混悬液连续灌胃实验SD大鼠,日剂量70mg/kg/1次,连续4周(分笼饲养,每笼4只,在相对湿度为50%-80%,室温22-26°条件下的清洁级环境中,全部予以标准自由摄食、饮水饲养),获取骨质疏松SD大鼠实验动物模型。5.实验动物干预处理。实验干预:A组,空白对照组,无菌生理盐水PBS处理;B组,单纯骨髓间充质干细胞移植治疗(以对照组同等计量的MSCs移植治疗处理);C组,转基因降钙素基因相关肽骨髓间充质干细胞移植治疗组(CGRP-MSCs移植治疗处理);D组,外源性神经生长因子联合转基因降钙素基因相关肽骨髓间充质干细胞移植治疗组(同等计量的CGRP-MSCs+NGF移植治疗处理)。6.实验标本收集、数据处理分析。分别在上诉实验干预处理后的第1、2、3w后,断颈法处死实验动物,三个时相每组随机选取5只,获取股骨组织标本,并提取总蛋白,和总RNA并反转录合成cDNA,使用实时定量荧光PCR法和Western blot检测法,检测3个时间阶段中各组大鼠股骨骨组织中CGRP mRNA和蛋白的相对表达水平,收集数据,采用spss19.0软件进行数据分析、处理。研究结果1.实验处理的3个时间相,与A组(空白对照组)比较,C组(CGRP-MSCs移植治疗处理组)和D组(CGRP-MSCs+NGF移植治疗处理)中CGRP的CGRP mRNA和蛋白表达水平均显著上调(P<0.01);2.实验处理1周后,C(CGRP-MSCs移植处理)和D(CGRP-MSCs+NGF移植处理)组上调水平差异明显(P<0.01),D组CGRP的CGRP mRNA和蛋白的表达水平低于C组;在实验处理2周后,C组和D组之间仍保持显著差异(P<0.05),D组CGRP的CGRP mRNA和蛋白的表达水平仍低于C组;3.实验处理3周后,C组和D组CGRP的CGRP mRNA和蛋白的表达水平上调水平差异明显缩小,二者差异无统计学意义(P>0.05)。研究结论1.无论是否使用外源性NGF,CGRP转基因骨髓间充质干细胞移植治疗骨质疏松大鼠,实验大鼠在CGRP的CGRP mRNA和蛋白的表达水平均提高,治疗效果肯定。2.外源性使用NGF联合CGRP转基因-MSCs移植治疗骨质疏松大鼠中,至少在CGRP的CGRP mRNA和蛋白表达层面,未表现出促进作用,并未表现出累计效应,而单纯的CGRP基因转基因-MSCs移植治疗骨质疏松大鼠疗效优于联合应用外源性NGF治疗方案。