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研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种常见的心血管疾病,是导致中风、心肌梗塞和周围血管疾病的重要原因。目前研究显示,炎症导致的血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)功能紊乱是AS的起始环节。因此,抗炎药物研究是AS药物治疗的热点方向。桑色素(morin hydrate, MO)是一种从蔬菜、水果和桑类植物中分离的黄酮类化合物,前期研究已发现其具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和诱导凋亡等药理作用,但是关于其是否具有抗AS作用以及具体的抗炎机制尚未见报道。自噬是一种存在于真核细胞内参与蛋白质和细胞器降解的“自食”现象。大量研究证实,自噬与多种疾病有关,如心肌重塑、心脏缺血再灌注损伤、癌症、衰老及多种神经退行性疾病如帕金森病、亨廷顿病和阿尔茨海默病等。有报道发现桑色素能够提高细胞cAMP水平,故我们推测桑色素是否能通过激活cAMP/PKA/AMPK/SIRT1通路而诱导HUVECs发生自噬,从而发挥抗炎作用。因此,本论文旨在研究桑色素在动物体内抗AS作用以及体外抗炎作用的分子机制。实验方法体外实验：采用TNF-a诱导HUVECs细胞炎症损伤模型,模拟AS发生时炎症对血管内皮细胞的损伤。采用CCK-8法检测不同浓度的TNF-a和桑色素对HUVECs细胞增殖的影响来确定TNF-α口桑色素的实验浓度。采用ELISA、免疫印迹法检测桑色素对‘TNF-a诱导HUVECs损伤后炎症因子(ICAM-1、MMP-9和COX-2)表达的影响；采用Western blotting法检测HUVECs细胞内MAP1LC3B2和SQSTM1/P62的表达水平来确定MO对自噬的影响。采用自噬抑制剂(3-methyladenine 、氯喹、ATG和ECN1 siRNA)、溶酶体绿色荧光探针,确证桑色素对HUVECs细胞自噬的影响；采用SIRT1的抑制剂(VPP和EX527)、ADCY抑制剂(KH7)和PDE4抑制剂(Rolipram)确定桑色素对HUVECs cAMP/PKA/AMPK/SIRT1信号通路的影响与其抗炎和诱导自噬作用的相关性。体内实验：采用高脂喂养ApoE-/-小鼠建立AS模型,观察桑色素对AS小鼠主动脉AS粥样斑块形成以及血脂水平的影响。实验分为三组(n=6/组)：2%吐温80溶剂对照组,30 mg/kg和100mg/kg桑色素组。高脂饲料喂食16周后,各组小鼠分别灌胃给药10周。实验结束后,称重,眼眶取血分析血脂(TC.TG, LDL-Ch和HDL-C)水平。分离主动脉血管,油红○染色判断AS粥样斑块面积,通过与溶剂对照组比较评价桑色素体内抗AS活性。实验结果体外实验：HUVECs细胞生长抑制试验结果显示,TNF-a浓度≤20 ng/mL、桑色素浓度≤20μM时,对HUVECs细胞生长增殖无明显影响。故后续试验采用10ng/mL的TNF-a来诱导HUVECs细胞炎症,观察1、10和20μM三个剂量的桑色素对HUVECs细胞炎症和自噬的影响。ELISA和Western blotting结果显示,桑色素对TNF-a诱导HUVECs细胞产生的炎症因子具有明显抑制作用,呈一定的剂量依赖性。桑色素对无炎症诱导的HUVECs细胞和TNF-a诱导的炎症HUVECs细胞均可诱导自噬作用,并抑制炎症因子(ICAM-1、MMP-9和COX-2)表达,而桑色素的抗炎作用可被自噬抑制剂(3-MA、氯喹、ATG和BECN1 siRNA)抑制。通过检测HUVECs细胞cAMP的释放量,结果发现桑色素可显著提高细胞cAMP释放水平,并激活cAMP/PKA/AMPK/SIRT1通路,诱导HUVECs细胞自噬,抑制炎症因子表达。用SIRT1抑制剂(EX527和VPP)后,桑色素诱导自噬作用、抑制炎症因子表达作用均被抑制。体外实验结果显示,MO通过激活cAMP/PKA/AMPK/SIRT1通路诱导HUVECs细胞自噬来发挥抗炎作用。体内实验：桑色素给药10周后,与溶剂对照组比较,30 mg/kg和100mg/kg桑色素组AS粥样斑块明显减少,血脂水平(LDL、TC和TG)显著降低,100mg/kg组的作用明显优于30 mg/kg组。各组小鼠体重无明显差异。体内实验结果显示,MO具有较好的抗AS活性,且无明显毒性。结论桑色素可降低AS小鼠体内血脂水平,抑制AS粥样斑块形成,表现出抗AS活性。其抗炎作用与激活cAMP/PKA/AMPK/SIRT1通路诱导HUVECs细胞自噬密切相关。因此,桑色素有潜力成为抗动脉粥样硬化的候选药物之一。