【摘 要】
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藜麦是一种富含营养和活性成分的粮食作物,经常食用可以降血糖血脂、提高人体免疫力等。皂苷是藜麦重要的活性物质,近年来受到研究者的关注。研究表明藜麦皂苷可以抑制多种癌细胞的生长,但是关于藜麦皂苷对结肠癌细胞的影响缺少系统研究。本文从藜麦种皮中提取分离皂苷,鉴定其结构,并对其抗结肠癌的作用进行研究,主要研究结论如下:（1）采用复合酶辅助乙醇提取法从藜麦种皮中提取皂苷,通过单因素和响应面法确定最佳工艺为:
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藜麦是一种富含营养和活性成分的粮食作物,经常食用可以降血糖血脂、提高人体免疫力等。皂苷是藜麦重要的活性物质,近年来受到研究者的关注。研究表明藜麦皂苷可以抑制多种癌细胞的生长,但是关于藜麦皂苷对结肠癌细胞的影响缺少系统研究。本文从藜麦种皮中提取分离皂苷,鉴定其结构,并对其抗结肠癌的作用进行研究,主要研究结论如下:（1）采用复合酶辅助乙醇提取法从藜麦种皮中提取皂苷,通过单因素和响应面法确定最佳工艺为:复合酶（果胶酶/纤维素酶质量比=1:1）添加量2.1%、酶解时间1 h、酶解温度48℃和p H 4.8,藜麦皂苷的提取量达到42.220 mg/g,比单一的乙醇提取法、纤维素酶辅助法或果胶酶辅助法分别提高了15.935 mg/g、6.647mg/g和8.531 mg/g。利用大孔树脂和半制备液相色谱分离藜麦粗皂苷得到一种藜麦皂苷单体,纯度达到90%以上。采用红外光谱、超高效液相色谱-飞行时间质谱和核磁共振波谱法鉴定其结构,结果显示,该藜麦皂苷单体的分子式为C48H76O20,名称为Phytolaccagenic acid 3-O-[β-D-glucopyranosyl-（1,3）-α-L-arabinopyranosyl]-28-O-β-D-glucopyranoside（藜麦皂苷A）。（2）运用流式细胞术和蛋白印迹等方法研究藜麦皂苷A对HT-29结肠癌细胞增殖的影响。结果显示,藜麦皂苷A以时间和剂量依赖性显著地抑制HT-29细胞的活力,藜麦皂苷A浓度为160μg/m L时对细胞活力的抑制效果最明显,该浓度处理细胞24 h、48 h和72 h后,细胞的存活率分别为25.89%、11.75%、8.53%,IC50分别为24.11μg/m L、18.87μg/m L、14.52μg/m L。藜麦皂苷A浓度从0增加到40μg/m L时,细胞周期p21蛋白的表达明显增加,Cyclin D1蛋白的表达明显减小,导致细胞周期被阻滞在G0/G1期。此时细胞中促凋亡蛋白Bax和Caspase3的表达水平也显著提高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低,使HT-29细胞发生凋亡。当藜麦皂苷A浓度为40μg/m L时,与对照组相比,G0/G1期的细胞数目比例增加22.97%,细胞凋亡率增加22.55%。藜麦皂苷A通过提高自噬特异性蛋白LC-3II和Beclin1表达,诱导细胞发生自噬,添加自噬抑制剂后明显降低了细胞增殖抑制率。（3）采用迁移试验、酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）和蛋白印迹等方法研究藜麦皂苷A对HT-29结肠癌细胞迁移的影响。结果显示,藜麦皂苷A浓度从0增加到40μg/m L时,细胞划痕愈合的面积和迁移的数量明显减少,细胞黏附能力也显著下降。此时,与对照组相比,细胞愈合率降低38.21%,迁移能力降低69.48%,黏附能力降低76.10%。酶联免疫检测发现藜麦皂苷A通过降低细胞迁移相关趋化因子VEGF、TGF-β1和CXCL-8的表达水平,抑制细胞迁移。蛋白印迹法检测细胞迁移EMT相关蛋白,发现藜麦皂苷A通过增加E-钙黏蛋白的表达,降低N-钙黏蛋白的表达,阻断EMT过程。
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