论文部分内容阅读
随着核工业的发展，核科学技术的广泛应用以及核恐怖袭击的威胁，如何救治急性辐射损伤成为了当今迫切的需求。肠道对电离辐射十分敏感，肠上皮结构和功能受损是急性辐射性病难以救治的关键因素之一。肠隐窝干细胞及其干细胞龛遭受严重破坏，是肠隐窝-绒毛更新障碍的根本原因，是肠上皮结构和功能放射性损伤的关键病理机制。因此，亟待根据急性放射性病病程中肠上皮结构和功能损伤的病理机理特点，提出新型有效的针对性救治策略。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）是一群来源于中胚层，异质性很强的具有自我更新能力的多能干细胞，能分化为脂肪细胞，成骨细胞，软骨细胞，肝细胞，神经元细胞，肌细胞，上皮细胞等细胞。此后大量研究表明，间充质干细胞可趋化至受伤发炎的部位，具备潜在的免疫调节能力，抗炎能力和营养作用，是组织工程，再生医学和自身免疫性疾病治疗的理想工具。新近发现的一种可溶性分子Rspo1（R-spondin1）可通过结合肠隐窝干细胞表面Lgr5和Lgr4的受体、竞争抑制Wnt通路拮抗剂DKK1等机制，调节并增强活化Wnt/β-catenin信号，促进肠隐窝干细胞增殖和分化。另外，人Rspo1可作用于小鼠肠隐窝干细胞，产生促增殖、分化和生存作用。鉴此，本文建立了肠上皮辐射损伤小鼠模型并观察了其损伤规律，通过基因转染的方法构建了一株稳定表达人Rspo1分子的间充质干细胞株并鉴定了其生物学活性，利用Rspo1基因转染的间充质干细胞株过继输注肠上皮辐射损伤小鼠，通过间充质干细胞发挥的免疫调节作用与Rspo1/β-catenin途径刺激肠隐窝干细胞增殖和分化的作用相联合，修复肠隐窝-绒毛更新机制，以期为急性放射病的有效救治提供新思路。一、肠上皮辐射损伤小鼠模型的建立及病理损伤规律【目的】建立肠上皮辐射损伤小鼠模型，观察损伤病理变化规律。【方法】分别以10Gy、12Gy、14Gy、16Gy和18Gy剂量单纯照射小鼠腹部，确定单纯腹部照射的最小致辐射死剂量。进而采用18Gy剂量照射Lgr5-EGFP-ires-CreERT2转基因小鼠，每日观察小鼠体重，并在辐照后0.5d、3.5d和6d取小鼠小肠，观察小肠的病理学改变规律，如小肠绒毛长度、肠隐窝数目以及肠隐窝Lgr5+干细胞的数量变化。【结果】18Gy为单纯腹部照射建立肠上皮辐射损伤小鼠模型的最小致死剂量；与未处理组相比，腹部照射后小鼠体重逐步减轻、小肠绒毛变短、隐窝数目减少、肠隐窝干细胞数量在短时间内迅速减少。【结论】本部分研究采用18Gy剂量单纯辐照小鼠腹部，建立了肠上皮辐射损伤小鼠模型。在此基础上观察了肠上皮辐射损伤病理规律。这为急性辐射损伤救治的研究提供了良好的研究工具。二、Rspo1基因转染间充质干细胞株的构建及生物学活性鉴定【目的】构建稳定表达Rspo1的基因转染间充质干细胞株。【方法】将人Rspo1全长cDNA重组入逆转录病毒载体pEGZ-Term，通过与辅助病毒载体共转染293T细胞，包装为具有感染力的完整重组病毒载体，收集培养上清感染间充质干细胞C3H10T1/2细胞株，筛选获得G418抗性的基因转染细胞，通过RT-PCR与流式细胞术检测感染后C3H10T1/2细胞Rspo1分子的表达，并采用细胞计数法观察其上清对结肠癌细胞株SW480增殖能力的促进作用。【结果】成功构建pEGZ-Term/Rspo1逆转录病毒表达载体，获得了稳定表达人Rspo1的基因转染细胞株C3H10/Rspo1，该细胞株上清能促进SW480结肠癌细胞增殖。【结论】建立了稳定表达Rspo1的基因转染间充质干细胞株，并证实其分泌的Rspo1具有生物学活性，为进一步利用Rspo1和间充质干细胞联合靶向作用于肠道干细胞救治肠上皮损伤的研究奠定了基础。三、Rspo1基因转染间充质干细胞修复小鼠肠上皮辐射损伤【目的】利用间充质干细胞的保护作用联合Rspo1靶向修复肠上皮辐射损伤小鼠。【方法】采用流式细胞术检测C3H10T1/2细胞株表面趋化因子受体和相关负性免疫分子的表达；通过胞内染色的方法，利用流式细胞术检测C3H10T1/2细胞株内相关免疫抑制与激活细胞因子的表达；利用ELISA法检测C3H10T1/2细胞上清中PEG2的含量；采用18Gy辐照剂量单纯照射小鼠腹部，将PBS、C3H10T1/2细胞株、第二部分构建的C3H10/mock细胞株及C3H10/Rspo1细胞株分别移植入肠上皮辐照损伤小鼠，每日观察小鼠的生存状况及体重变化。【结果】C3H10T1/2细胞株可表达趋化因子受体CXCR4和PD-L1、B7H3、B7H4等多种负性免疫分子，产生TGF-β、IL-10、IL-4和分泌PGE2等免疫抑制因子；对于肠上皮辐照损伤小鼠，C3H10/Rspo1移植组小鼠的存活率大于单纯C3H10T1/2移植组小鼠的存活率，而PBS移植组小鼠在两周内全部死亡，同时C3H10/Rspo1移植组小鼠体重降低明显低于单纯C3H10T1/2移植组。【结论】C3H10/Rspo1细胞株可通过表达的趋化因子受体定向的趋化至辐照损伤的肠上皮部位，通过发挥免疫抑制作用保护受损肠道干细胞，并分泌Rspo1分子，修复受辐照损伤的肠上皮。