背景:肺炎克雷伯菌是临床常见的机会致病菌,不仅能导致肺炎、泌尿系统感染等,还可以引起肝脓肿、脑膜炎和眼内炎。强毒株和抗生素耐药菌株的出现使肺炎克雷伯菌成为仅次于大肠杆菌的条件致病菌,尤其是K1和K2血清型肺炎克雷伯菌由于具有很强的侵袭力和抗吞噬能力在临床更常见。细菌的致病过程是一个感应宿主各类环境,从而调控相关基因表达的过程,在这个过程中细菌受到多种调控因素的影响,包括转录调控因子和转录后调控因子的调控作用。其中肺炎克雷伯菌KP1＿RS12260（kbv R）基因编码的蛋白是一类转录调控子。课题组前期敲除肺炎克雷伯菌kbv R基因以后发现细菌荚膜和生物膜的形成受到影响。目的:本课题将继续研究肺炎克雷伯菌kbv R基因在细菌致病性及细菌适应机体环境过程中的作用,并初步评估kbv R基因敲除株的免疫保护力。方法:课题组前期已经构建肺炎克雷伯菌kbv R基因敲除株（△kbvR）和kbv R基因回补株（C-kbvR）。本课题首先分别经小鼠皮下、腹腔和消化道途径感染kbv R基因敲除株（△kbvR）或野生株（WT）,通过观察小鼠存活情况和计算相关器官细菌载量,分析kbv R基因在肺炎克雷伯菌致病过程中的作用。通过比较生长曲线及活菌数分析kbv R基因在细菌适应机体各种微环境（包括胆盐、酸性环境、H₂O₂及高渗环境）中的作用,并利用体内和体外巨噬细胞与细菌相互作用实验评估kbv R基因在细菌抗巨噬细胞吞噬过程中的作用。通过RNA-Seq测序从全基因组的角度了解kbv R基因敲除株与野生株基因表达的差异并筛选出部分可能受Kbv R调控的致病相关基因并利用大肠杆菌表达系统克隆表达并纯化Kbv R蛋白。在此基础上,以kbv R基因敲除株免疫小鼠并初步分析其免疫保护效果,评估kbv R基因敲除株作为减毒活疫苗株的可能性。结果:1.kbv R基因敲除后不影响细菌的生长速度,而在小鼠皮下、腹腔及消化道感染模型中,△kbv R的致病力明显低于WT对照组。皮下与腹腔分别感染10⁷ cfu/m L与10⁴ cfu/m L的WT后,小鼠在两天内全部死亡,而△kbv R感染的小鼠在感染后7天仍然全部存活。在消化道感染模型中,感染10⁸ cfu/m L WT的小鼠在感染后5天大肠、小肠及肝脏的细菌载量均明显高于△kbv R感染的小鼠。2.在酸性环境和H₂O₂中,△kbv R与WT的生长无明显区别。但在胆盐环境和高渗环境中,kbv R基因敲除株的生长明显比WT好。3.当kbv R基因敲除株腹腔感染小鼠24 h后,分别取小鼠血液涂板培养,腹腔灌洗液涂片染色,结果均未观察到肺炎克雷伯菌的存在,而WT菌株感染小鼠后,血液及腹腔灌洗液均能检测到细菌。体外巨噬细胞侵袭实验发现,当kbv R基因敲除后,细菌对巨噬细胞的黏附作用明显增强,而抗吞噬能力下降。4.通过RNA-Seq测序结果显示1410个基因的转录受到Kbv R的调控,其中包括细菌荚膜、菌毛、脂多糖、离子获得相关基因。5.初步免疫保护实验证明皮下免疫注射10⁴ cfu/m L的△kbv R后,小鼠在攻毒实验中生存率提升50%,表明△kbv R能够为小鼠提供部分保护力。结论:kbv R是一种全局性调控因子,它与细菌致病性密切相关并且在细菌感应外界胆盐环境、高渗环境中起到负调控作用。kbv R基因影响细菌对巨噬细胞的抗吞噬功能和肠道定植能力,进而影响细菌致病力。初步免疫保护实验证明△kbv R能够起到一定保护作用,为下一步高致病性肺炎克雷伯菌减毒活疫苗的研发提供新思路。