【背景】胃癌是一种常见的危害人类健康的恶性肿瘤之一。由于其病因和发病机理尚不清楚,目前在临床上尚缺乏有效的早期诊断方法。除早期胃癌外,大多数的进展期胃癌患者就诊时,已失去外科手术时机,临床治疗效果差,多数患者死亡于肿瘤浸润、转移、术后复发和化疗后多药耐药,而导致肿瘤浸润、转移、复发和多药耐药等生物学特征主要取决于胃癌的恶性表型及其表现特征。因此,深入探讨胃癌恶性表型的分子机制,对于阐明胃癌细胞的增殖、侵袭、转移和多药耐药等发生机理十分必要,同时对于提高胃癌早期诊断、疗效预测和判定,改善胃癌患者预后具有十分重要的意义。近年来研究发现,SOX2是一个重要的胚胎发育相关的转录因子,它与其它几个转录因子(KLF4,OCT4,c-MYC等)组合表达,可诱导多种分化成熟的体细胞逆分化为干细胞样的、具有自我更新和多向分化潜能的iPS(诱导的多向分化潜能干细胞)细胞。表明其与细胞的分化、生长、增殖密切相关。肿瘤是由于细胞分化成熟障碍,生长增殖失控而导致的一种复杂的病理现象。目前大量的研究集中于探讨SOX2在诱导iPS细胞中的作用,那么是否可以通过SOX2诱导胃癌细胞的分化,逆转胃癌细胞的恶性表型呢?本课题首先通过免疫组化、PCR、WB等方法,证实SOX2在胃癌中的表达明显降低,然后通过功能获得性方法研究SOX2对胃癌恶性表型的影响,再利用Chip-DSL芯片等高通量的方法,揭示SOX2影响胃癌恶性表型的作用机制,进而探索以其为靶点的治疗胃癌的新策略。【目的】通过观察SOX2在胃癌中的异常表达,研究SOX2对胃癌细胞恶性表型的影响及其作用机制,探索以SOX2为干预靶点对胃癌细胞恶性表型的逆转效果,为胃癌的靶向治疗提供新的理论依据和实验基础。【方法】1.采用免疫组化、qRT-PCR、Western blot,分别检测SOX2在胃癌组织、胃癌细胞株和癌旁组织中的表达水平及胃癌发生发展中的表达变化,并统计分析SOX2的异常表达与胃癌临床病理参数的关系。2.分别将SOX2的表达载体及空载体转染胃癌细胞MKN28,上调SOX2的表达,建立一株稳定高表达SOX2的胃癌细胞株MKN28-SOX2,并对其进行验证。3.用WST-1细胞增殖实验和裸鼠皮下成瘤实验观察上调SOX2对胃癌细胞生长增殖的影响;流式细胞仪检测胃癌细胞周期的改变;Annexin V /PI双染流式细胞术检测其对胃癌细胞凋亡的影响。4.利用体外的Transwell迁移、侵袭实验,划痕实验,体内的裸鼠尾静脉注射内脏转移实验检测上调SOX2后胃癌细胞的转移及侵袭恶性表型变化。5.通过ChIP-DSL启动子芯片技术,找出含有SOX2结合位点、直接调控的靶基因,用全基因组表达谱芯片,筛选出SOX2过表达后差异表达的基因。取二者交集---既直接与SOX2结合又差异表达的基因,这些基因即是介导SOX2影响胃癌恶性表型的靶基因;再运用生物信息学方法,分析这些靶基因的功能、所涉及的信号通路,揭示SOX2影响胃癌细胞恶性表型的作用机制。【结果】1. qRT-PCR和Western blot的检测结果表明,SOX2的mRNA和蛋白在胃癌组织和胃癌细胞系MKN28,MKN45,SGC7901,KATⅢ中的表达水平均显著低于其在正常胃粘膜和胃粘膜永生化细胞系GES中的表达。组织芯片的免疫组织化学检测表明SOX2在胃癌组织中的表达水平明显低于正常胃粘膜,且其在正常胃粘膜、慢性胃炎、胃腺瘤中及胃癌组织中的表达水平呈现逐渐降低的趋势。SOX2的表达与胃癌患者的性别、年龄、临床分期无显著相关,而与分化程度密切相关。2.成功的将SOX2的表达载体转染胃癌MKN28细胞,通过特异性的SOX2的引物行PCR实验及SOX2的抗体进行Western blot实验验证,均证实SOX2的表达载体能成功地上调MKN28细胞中SOX2的表达。3. WST-1细胞增殖实验和裸鼠皮下成瘤实验结果显示上调SOX2的表达水平后,胃癌细胞生长增值能力明显减弱;流式细胞仪分析结果表明,上调SOX2表达后,胃癌细胞出现G1期阻滞,细胞凋亡明显增加。划痕实验、Transwell侵袭和迁移实验结果表明SOX2的过表达对胃癌细胞的迁移和侵袭能力的影响并无统计学意义。4. ChIP-DSL技术筛选出了785个SOX2直接结合的靶基因。人类全基因组表达谱芯片结果显示,SOX2上调后导致410个基因差异表达,其中351个基因表达升高,59个基因表达降低。SOX2直接结合又能引起差异表达的基因仅有10个。生物信息学分析结果显示,这10条基因,与凋亡密切相关的为MSH6,与细胞周期密切相关的有BCL2L1、MAP2K4。【结论】1. SOX2在胃癌中表达降低,且在胃癌的发生发展中呈现逐渐降低趋势,SOX2的表达水平与胃癌的分化程度密切相关,SOX2可能参与了胃癌的分化及发生发展。2.成功建立了一株SOX2过表达的胃癌细胞株MKN28-SOX2,为研究SOX2在胃癌中的作用机制提供了良好的细胞模型。3. SOX2主要通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡抑制胃癌细胞的生长、增殖。4. SOX2可能是通过调控BCL2L1、MAP2K4基因参与细胞周期的调控,通过调控MSH6基因诱导胃癌细胞凋亡。