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植酸酶(myo-inostol hexakisphosphate phosphohydrolase, EC 3.1.3.8)是一种能降解植酸(肌醇六磷酸)为肌醇和磷酸的酶。具有增加动物对矿物质的利用,促进动物的生长发育,降低磷的排放量和减少环境污染的作用。植酸及植酸盐广泛存在于植物组织及相应的粮食产品中,植酸磷的含量占总磷的60%以上,因其不能被单胃动物利用,直接被排出体外,加重了环境中磷的污染且造成磷资源的浪费,并使得养殖业要额外加入动物能利用的磷源,提高了成本。在单胃动物饲料中添加植酸酶可有效解决这一问题。本文采用底物消解法筛选出一株高产植酸酶的黑曲霉,命名为Aspergillus niger N-3,并以此为原材料,采用PCR法克隆植酸酶基因;对该菌株直接发酵产生的胞外植酸酶进行了纯化,并在此基础上研究了该酶的基本酶学性质;此外,本文还以毕赤酵母表达的Aspergillus sp.植酸酶为材料,用化学修饰法研究了植酸酶参与催化的必需氨基酸残基——组氨酸残基。主要研究结果如下:1.高产植酸酶菌株的筛选从不同来源的土壤及其它样品中分离得到104株菌,从中筛选获得76株能够产生透明消解圈的菌株,液体发酵证明,有30株菌具有分泌胞外植酸酶的能力。其中大多数酶活力在8 U/mL -50 U/mL之间,酶活最高的一株菌株液体发酵时其酶活最高可达495 U/mL,此菌株命名为Aspergillus niger N-3,并以此作为本课题的主要研究材料。2.植酸酶基因的克隆采用氯化苄法提取黑曲霉Aspergillus niger N-3的基因组,以此为模板应用特异引物对植酸酶基因phyA进行PCR扩增,构建克隆载体并对阳性克隆进行测序鉴定。该植酸酶基因的编码区有1347个核苷酸,编码448个氨基酸。其核苷酸序列与Aspergillus niger NRRL3135 phyA基因的同源性为91.5%(不含内含子序列),推导的氨基酸序列同源性为94.87%,与大多数来源于曲霉的植酸酶(phy A)类似,具有10个潜在的糖基化位点。3.植酸酶的纯化将Aspergillus niger N-3发酵液首先采用硫酸铵分级沉淀的方法进行粗分离,加入30%饱和度的硫酸铵溶液沉淀3 h后,离心收集上清,采用80%饱和度的硫酸铵溶液继续沉淀,8 h后离心,沉淀溶于100 mM NaAc-HAc pH 5.5缓冲液,透析并浓缩,将浓缩液过Sephadex G-75分子筛层析纯化,获得两个峰,其中一个峰具有植酸酶活性,其峰顶处的组分经SDS-PAGE检测为单一条带并测得其分子量60-80 kDa。4.植酸酶的酶学性质Aspergillus niger N-3所产植酸酶最适反应温度为55°C(保温10分钟),最适pH分别为pH 2.0和pH 5.5,其中pH 2.0处的酶活力比pH 5.5处的酶活力高约30%,更适合于单胃动物的消化道环境。该酶热稳定性较好,在80°C、85°C及90°C下处理5分钟,仍分别保持57%,49%和45%的酶活力。以植酸钠为底物时测得Km为132.3μM,以pNPP为底物测得Km为2.23 mM,说明该酶对植酸钠具有更高的亲和力。5. IAA和DEP修饰其组氨酸残基时的酶的失活动力学以毕赤酵母表达的Aspergillus sp.植酸酶(phy A)为材料,采用冷丙酮沉淀法得到了纯酶,用IAA和DEP修饰其组氨酸残基研究植酸酶失活动力学。结果表明,组氨酸残基位于活性部位,由IAA引起的酶的失活是配合型的抑制,而由DEP引起的酶的失活则是构象变化型抑制,求出了各自的抑制参数。