禽流感(avian influenza,AI)是一种由禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起的严重危害畜牧业和人类健康的烈性传染性疾病,已多次发生禽流感病毒直接感染人,致多人死亡的事件,禽流感已成为人类面临的又一重大传染性疾病,严重威胁着全球公共卫生安全,越来越受到国际医学界及各国政府的高度重视。AIV感染机体后,迅速在呼吸道复制病毒,继而导致机体过度免疫应答,损伤肺泡上皮及毛细血管内皮细胞,出现类似急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的临床表现,在AI的发病过程中,细胞炎症因子的过度表达及相互作用、促炎和抗炎反应不平衡是发生急性肺损伤的根本原因。目前临床治疗主要以抗病毒及对症支持治疗为主,疗效不佳,病死率极高。随着干细胞多向分化潜能研究的深入,干细胞在肺组织修复重建方面的应用也引起许多学者的关注,有不少采用间充质干细胞、骨髓干细胞在动物模型上修复受损肺组织的报道,从而为临床治疗开辟了一条新的途径。在本课题中,我们首先建立小鼠AI模型并检测趋化因子及炎症因子在损伤部位的表达情况,进而将MSCs应用于禽流感的早期治疗,发挥其免疫调节功能,降低机体的过度炎症反应,减轻肺组织损伤,改善肺功能,为MSCs在治疗AI的临床应用提供理论指导。全文分为三部分:第一部分小鼠禽流感(AI)模型的建立一、目的采用H9N2禽流感病毒(AIV)建立小鼠禽流感(AI)模型,检测感染小鼠的炎性反应、肺功能和肺组织急性损伤程度,探讨AI小鼠肺组织的炎症因子的表达情况。二、方法1、H9N2(A/PH/CA/2373/98)禽流感病毒由南京大学医学院邢铮教授惠赠,尿囊腔途径接种9日龄SPF鸡胚,48小时后收集鸡胚尿囊液,离心后收集病毒,感染MDCK细胞,测TCID50。2、C57BL/6雌性小鼠乙醚吸入麻醉后,H9N2禽流感病毒滴鼻建立禽流感(AI)模型。在AI模型建立后于1、3、7、14天经左心室取血后处死小鼠,血气分析检测动脉血氧分压(PaO2)及二氧化碳分压(PaCO2),血常规检测血白细胞及单核细胞表达,组织病理切片观察肺组织损伤情况,确认AI模型建立成功。3、取1、3、7、14天AI模型小鼠肺组织和血清,通过real-time RT-PCR、和ELSIA 方法检测炎症因子:interleukin-1(IL-1α)interleukin-6(IL-6),tumor necrosis factor(TNF-α)and interferon(IFN-γ)在损伤肺组织内和血清中的表达水平。三、结果1、鸡胚扩增后,得到H9N2禽流感病毒的终浓度为1×1011.4pfu/ml。2、H9N2禽流感病毒滴鼻可以感染小鼠,导致急性肺损伤,血气分析显示感染后动脉血PaO2降低,二氧化碳分压PaCO2升高;血常规检测结果发现血白细胞数及单核细胞比例下降;组织病理切片表明AI模型建立后,小鼠肺泡上皮损伤和肺间隙水肿,炎症细胞大量聚集于肺,肺炎性变明显,正常肺组织结构严重破坏。3、AI模型小鼠接种病毒24小时后,肺组织和血清中炎症因子IL-1α,IL-6,TNF-αandIFN--γ表达明显升高,3天左右达到峰值,并可以维持表达两周左右。四、结论采用H9N2禽流感病毒滴鼻成功地建立了小鼠禽流感模型。该模型小鼠肺功能损伤:动脉血PaO2降低及二氧化碳分压PaCO2升高;肺组织结构损伤:肺实质细胞损伤和肺间质水肿,炎症细胞浸润。接种病毒后小鼠血清及肺组织中炎症因子IL-1 α,IL-6,TNF-α and IFN-γ表达水平明显上调,损伤3天左右表达水平达到峰值,且可维持两周左右。第二部分MSCs移植对AI的免疫调节作用研究一、目的体外培养MSCs,构建GFP蛋白重组腺病毒,转染MSCs并检测目的蛋白GFP的表达情况。将MSCs-GFP用于禽流感的治疗,评估MSCs应用于AI早期治疗的作用和效果,并探讨其作用机制。二、方法1、购买构建好的重组GFP腺病毒以MOI = 10的比例转染HEK293A包装细胞系,反复扩增3次,提取病毒液,WB鉴定后用TCID50(Tissue Culture Infection Dose 50)法进行病毒滴度测定。2、C57BL/6骨髓间质干细胞购自赛业(广州)生物科技有限公司,体外培养,选择稳定培养4代的MSCs,重组腺病毒以MOI=100转染第四代MSCs,荧光显微镜下观察转染效率,CCK8法绘制细胞生长曲线,免疫荧光技术检测MSCs转染后目的基因GFP的表达情况。3、H9N2禽流感病毒建立AI模型同时,经尾静脉注射转染的MSCs,实验小鼠随机分为4组,空白对照组(Control组):未经H9N2禽流感病毒滴鼻处理,也不接受MSCs移植;对照组(MSCs组):未经H9N2禽流感病毒滴鼻处理,尾静脉注射MSCs-GFP;模型组(AI组):经H9N2禽流感病毒滴鼻造模,尾静脉注射生理盐水;MSC治疗组(AI+MSC组):经H9N2禽流感病毒滴鼻造模,尾静脉注射转染的MSCs-GFP。于移植MSCs第3、7天处死小鼠,取肺组织,取动脉血进行血气分析检测动脉血氧分压(Pa02)及二氧化碳分压(PaC02);组织病理切片观察肺组织损伤情况;流式细胞术检测MSCs的归巢情况,评估MSCs对AI小鼠肺功能及肺组织的修复效果。4、液相蛋白芯片技术,real-time PCR检测血清中趋化因子GM-CSF,KC,MCP,MIP-1α 和 MIG,炎症因子 IL-1α,IL-6,IL-10,TNF-α和 IFN-γ,血管内皮生长因子VEGF和纤维生长因子bFGF等细胞因子的表达,以及肺组织中IL-1α,IL-6,IL-10,TNF-α和IFN-γ的mRNA表达水平。确定各组动物的免疫反应程度。三、结果1、重组GFP腺病毒感染293A细胞,经大量扩增纯化后,最终得到1×108.8 pfu/ml的高滴度病毒液,WB鉴定证明腺病毒携带目的基因GFP。2、小鼠MSCs聚集生长,呈长梭型,漩涡状排列,符合骨髓间充质干细胞特征。重组腺病毒以MOI=100时转染MSCs为最佳,不会导致MSCs出现病理反应且转染效率最高,转染48小时后达到90%以上,细胞生长曲线亦表明腺病毒转染(MOI=100)对MSCs增殖能力无明显影响。免疫荧光检测结果表明转染后的MSCs明显高表达目的蛋白GFP,转染48小时左右GFP表达水平达到峰值,并维持高表达。3、MSCs移植后,血气分析结果显示AI+MSC组小鼠Pa02显著高于AI模型组小鼠,PaCo2显著低于AI模型组小鼠;组织病理切片观察结果:AI+MSC组小鼠肺组织损伤情况较AI模型组小鼠有显著改善。4、液相蛋白芯片技术检测结果:与AI模型组小鼠相比,AI+MSC组小鼠血清中趋化因子 GM-CSF,KC,MCP,MIP-1α 和炎症因子 MIG,IL-1α,IL-6,TNF-α和IFN-γ的表达均显著下降,IL-10,VEGF和bFGF表达显著上升;real-time PCR检测AI+MSC组小鼠肺组织中IL-1α,IL-6,TNF-α和IFN-γmRNA表达显著下降,IL-10表达显著升高。四、结论MSCs应用于AI的早期治疗,可发挥其免疫调节功能,降低AI小鼠血液及肺组织中趋化因子及炎症因子的表达,从而降低机体的过度炎症反应,减轻肺组织损伤,改善肺功能。第三部分调控Wnt信号通路对MSCs向成纤维细胞分化的影响研究一、目的研究Wnt/β-catenin信号通路在MSCs向成纤维细胞分化过程中的作用,确认抑制Wnt/β-catenin信号通路能够抑制MSCs向成纤维细胞分化,为临床治疗禽流感提供有价值的参考。二、方法1、差速贴壁分离法培养小鼠MSCs,选择稳定培养3-6代的MSCs,流式细胞仪技术鉴定 MSCs 表面标志 CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD79 的表达。2、体外培养的MSCs,随机分为5组,对照组:正常培养的MSCs;MSCs+TGF-β组.:培养液中加入0.5ng/ml的TGF-β,诱导MSCs向成纤维细胞分化;MSCs+DKK1组:培养液中加入20ng/ml的DKK1,抑制Wnt/β-catenin信号通路;MSCs+ TGF-β+DKK1 组:培养液中加入 0.5ng/ml 的 TGF-β 以及 100ng/ml的DKK1,抑制Wnt/β-catenin信号通路的同时诱导MSCs向成纤维细胞分化。3、取体外培养第2、3、4、5代次MSCs,real-time PCR、免疫荧光技术检测各组 MSCs 中 β-Catenin、TCF、GSK-3β、Axin1、JNK,验证 Wnt 信号通路的激活与抑制。4、WB和real-time PCR分别检测各组MSCs的成纤维细胞标记Vimentin、α-SMA以及TE-7的表达情况,检测Wnt信号通路激活和抑制对MSCs向成纤维细胞分化的影响。三、结果1、体外分离培养的小鼠MSCs聚集生长,呈长梭型,漩涡状排列。3-6代MSCs表达 CD73、CD90、CD105(+),不表达 CD34、CD45、CD79(-)。2、TGF-β诱导MSCs向成纤维细胞分化的过程中,Wnt信号通路高度激活。免疫荧光技术检测结果显示:MSCs+TGF-β组细胞中Wnt信号通路分子β-Catenin、TCF、GSK-3β、Axin1、JNK 表达明显增高。3、在诱导MSCs向成纤维细胞分化的过程中加入DKK1,免疫荧光技术检测结果显示:MSCs 中 Wnt 信号通路分子 β-Catenin、TCF、GSK-3β、Axin1、JNK表达趋于正常。4、WB和real-time PCR分别检测各组MSCs的成纤维细胞标记Vimentin、α-SMA以及 TE-7。结果显示 TGF-β+MSCs 组 MSCs 中 Vimentin、α-SMA 以及 TE-7 的表达上调,与之相比,MSCs+ TGF-β+DKK1组中Vimentin、α-SMA以及TE-7呈低表达。四、结论在MSCs向成纤维细胞分化过程中,Wnt/β-catenin信号通路呈激活状态。Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK1能够抑制MSCs向成纤维细胞分化。