糖尿病神经病变是糖尿病常见的慢性并发症之一。大量研究表明,氧化应激反应、炎症因子释放以及细胞的凋亡在糖尿病神经病变中起重要作用。目前,对于糖尿病神经病变尚无有效的防治措施!近年众多研究表明,低浓度氢分子(<4%)及富氢液具有选择性抗氧化、抗炎、抗凋亡作用,并已证明可应用于多种疾病动物模型的治疗,如:脏器的缺血/再灌注损伤、神经退行病变、脓毒血症等。因此,越来越多的学者认为氢气与富氢液是一种新型的医学气体分子。本课题利用离体高糖培养的雪旺细胞(RSC 96)和在体糖尿病大鼠模型,探讨富氢液对糖尿病神经病变保护作用的可能机制,为临床治疗奠定基础。实验一、富氢液对高糖诱导雪旺细胞损伤的影响目的:高血糖诱发的氧化应激、炎症反应以及导致的雪旺细胞的凋亡在糖尿病神经病变的病理生理过程中具有重要意义。富氢液具有选择性抗氧化、抗炎、抗凋亡作用。本实验拟利用高糖培养下的雪旺细胞(RSC96),探讨富氢液对于高糖培养的雪旺细胞影响。方法:大鼠永生化雪旺细胞株(RSC96细胞)培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基,接种于6孔或96孔细胞培养板,3 m L/孔或200μL/孔,细胞密度2×l06/m L。第一部分:不同浓度高糖诱导下对雪旺细胞的影响,体外培养的雪旺细胞分为5组(n=30):正常对照组(5.6mmol/L)和高糖组(25 mmol/L、50mmol/L、100mmol/L)、甘露醇组,分别于培养24h、48h、72h应用MTT(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)法检测高糖对RSC96细胞增殖的影响;同时应用酶联免疫法检测炎症细胞因子(IL-1β,HMGBl)、氧化应激产物(MDA、8-羟基脱氧鸟苷)变化情况。第二部分:富氢培养液对高糖培养的雪旺细胞影响。1.体外培养的RSC96雪旺细胞接种于培养皿培养48 h,采用随机数字表法将细胞分为6组(n=6):正常对照(Con)组、高糖(HG)组(根据第一部分实验结果,50mmol/L高糖组入选)、富氢水(HS)组、HG+HS(0.15/0.30/0.60mmol/L)组,细胞培养采用正常培养液与不同浓度的含氢培养液培养,给予或不给予高糖处理,48 h后收集细胞培养液,应用MTT法检测各组细胞增殖情况。2.探讨饱和富氢培养液对于高糖所致雪旺细胞氧化应激、炎症反应以及凋亡的作用。实验分为三组(n=6):正常对照(Con)组、高糖(HG)组、HG+HS(根据第二部分实验,0.60mmol/L组入选)。对照组培养基含糖5.6mmol/L,HG组含糖50 mmol/L,HG+HS组为含有0.6mmol/L氢分子的高糖培养基。48h末,进行超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量;Elisa法测定炎症因子IL-6、HMGBl的水平;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Western blot法检测细胞活化的半胱氨酸天冬氨酸酶3(Caspase-3)表达水平。观察含氢培养液对高糖诱导的雪旺细胞的损伤(氧化应激、炎症反应以及细胞凋亡)的影响。结果:第一部分:1.与Con组细胞相比,在24h、48h、72h末高糖处理组的氧化应激产物MDA、8-OHDG,细胞促炎症因子的释放均明显增加,但在48h更为明显;甘露醇组细胞无明显变化;2.MTT法检测结果表明,与对照组细胞相比在24h、48h、72h末,高糖处理组成活细胞数量少、死亡率高,且在48h末最为明显(P<0.05)。3.与对照组相比较,在高糖处理组中50mmol/L组,氧化应激产物生成、炎症因子释放、细胞死亡率升高更为明显(P<0.05)。4.Con组与甘露醇组相比,上述指标无明显差异(P>0.05)。氧化应激反应、炎症因子的释放参与高糖诱导雪旺细胞增殖,影响细胞的活力;各高糖处理组在48h时对体外培养雪旺细胞损伤最为严重,其中50mmol/L高糖培养基损伤最为严重。第二部分:MTT法结果表明:给予不同浓度的含氢培养液处理对于正常培养液雪旺细胞的增殖活力无明显影响(P>0.05);给予不同浓度的含氢培养液处理均可以显著降低含高糖培养基对于雪旺细胞的损伤,且0.60mmol/L的含氢培养液作用效果明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。与Con组相比,HG和HG+HS组SOD活性下降,炎症因子释放(IL-6与HMGBl),MDA含量、细胞内活化的caspase-3蛋白以及凋亡的雪旺细胞数目表达均明显升高(P<0.05);与高糖组比较,HG+HS组细胞活力升高,SOD活性升高,MDA含量减少,IL-6、HMGB-l水平、细胞凋亡数目以及细胞内活化的Caspase-3蛋白表达均明显降低(P<0.05)。结论:给予不同浓度的含氢培养液处理均可以抑制氧化应激反应的损伤;降低促炎症因子的释放;下调Caspase-3活化片段蛋白的表达,减少高糖诱导下雪旺细胞的凋亡,其中0.60mmol/L的含氢培养液处理效果最为明显。实验二、饱和富氢液对糖尿病外周神经病变大鼠的保护作用目的:饱和富氢液是一种溶解氢气至饱和状态的生理盐水,通过体外高糖培养雪旺细胞离体模型的研究发现,富氢液具有抗氧化、抗炎、减少高糖诱导雪旺细胞凋亡的作用。本实验以前期体外培养雪旺细胞实验研究为基础,利用糖尿病大鼠实验模型,拟探讨饱和富氢液对糖尿外周神经病变治疗效果。方法:健康雄性SD大鼠,体重280-310g(中国军事医学科学院实验动物中心)。腹腔注射链脲霉素(65 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型。第一部分:不同剂量的饱和富氢液对于糖尿周围神经病变大鼠模型的保护作用。40只大鼠随机分为5组(n=6),正常对照组(Con组),糖尿病模型组(DM组)、饱和富氢液处理组(DM+HS 5 ml,10ml,20ml/kg组)。建立糖尿病模型成功4周后,DM+HS组大鼠腹腔注射不同剂量饱和富氢液(5 ml,10ml,20ml/kg/day)连续治疗4周,Con组与DM组大鼠腹腔给予生理盐水注射持续4周,观察各组大鼠神经疼痛行为学在不同时间点(5thW、6thW、7thW、8thW末)变化。检测各组大鼠基础情况下及第4、8周末,坐骨神经传导速度(MNCV)的变化;第8周末,检测血糖水平及糖基化终末产物含量,坐骨神经炎症因子(HMGB1、TNF-α、IL-1β及IL-10)水平、氧化应激产物的含量(MDA、SOD)。第二部分:饱和富氢液对于糖尿周围神经病变大鼠模型坐骨神经细胞凋亡的影响。18只大鼠随机分为3组(n=6),正常对照组(Con)组、糖尿病模型组(DM)、饱和富氢液处理组(DM+HS 10ml)。HS(10ml/kg/day)组给予饱和富氢液连续治疗4周,Con组、DM组给予同等体积的生理盐水,8周末,Western blot法检测坐骨神经细胞中活化的Caspase-3、Bax以及Bcl-2蛋白表达水平。结果:第一部分第8周末,与基础值相比,Con组大鼠体质量增加,糖基化终末产物、血糖水平、神经痛阈、MNCV坐骨神经炎症因子水平与基础值比较无明显变化。与Con组大鼠相比,糖尿病大鼠体质量降低、糖基化终末产物、血糖水平明显升高、痛阈值明显降低、炎症因子释放与氧化应激产物含量增加(P﹤0.05);与DM组相比,饱和富氢液治疗的各组大鼠体质量和血糖水平无明显改善(P>0.05),但大鼠坐骨神经传导速度增加、热痛阈和机械性痛阈提高(P﹤0.05),坐骨神经中氧化应激产物含量以及TNF-α、HMGB1、IL-1β水平降低,IL-10水平升高,且10ml/kg饱和富氢液治疗组效果最为明显(P﹤0.05)。第二部分:与Con组相比,DM组与HG+HS组大鼠坐骨神经中活化的Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达增加,与DM组相比较,HG+HS组大鼠坐骨神经中活化的Caspase-3、Bax蛋白表达减少,Bcl-2蛋白表达增加(P﹤0.05)。结论:氧化应激、炎症因子释放以及细胞凋亡参与了糖尿病周围神经病变的发生发展;饱和富氢液可通过抗氧化、抗凋亡、调节炎症因子释放,对糖尿病周围神经病变产生保护作用。实验三、线粒体ATP敏感性钾通道参与富氢液对糖尿病外周神经病变大鼠的保护作用目的:饱和富氢液可通过抗氧化、抗凋亡、调节炎症因子释放,有效的减轻糖尿周围神经病变损伤。线粒体ATP敏感性钾通道(Mito KATP通道)是多种处理措施或药物的作用靶点,该通道激活后可有效的减轻神经细胞的损伤。本实验拟探讨饱和富氢液对糖尿周围神经病变保护机制,是否与线粒体ATP敏感性钾通道激活相关。方法:腹腔注射链脲霉素(65 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型,18只糖尿病大鼠,随机分为3组:分为糖尿病组(DM组)、富氢水治疗组(HS组)、ATP敏感钾通道阻滞剂组(5-HD组)。HS组、5-HD组大鼠造模成功4周后,给予腹腔注射饱和富氢液(10ml/kg/day)连续治疗4周,DM组给予腹腔注射生理盐水(10ml/kg/day)。第8周末,检测各组大鼠坐骨疼痛行为学变化、神经传导速度功能的变化;并检测坐骨神经炎性因子(HMGB1、TNF-α、IL-1β、及IL-10)、氧化应激水平及坐骨神经细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达情况。结果:(1)第8周末,各组糖尿病大鼠体质量降低、血糖水平升高;与DM组、5-HD组相比,饱和富氢液治疗组血清糖基化终末产物明显降低,糖尿病组与5-HD组相比无明显变化(P﹤0.05);(2)第8周末,与饱和富氢液治疗组相比,糖尿病组、5-HD组大鼠坐骨神经传导速度减慢、热痛阈和机械性痛阈降低(P﹤0.05);糖尿病组与5-HD组相比无明显变化(P>0.05)。(3)第8周末,与饱和富氢液治疗组相比,糖尿病组、5-HD组大鼠坐骨神经HMGB1、TNF-α、IL-1β表达水平升高,IL-10表达水平降低(P﹤0.05)。(4)第8周末,与饱和富氢液治疗组相比,糖尿病组、5-HD组大鼠坐骨神经凋亡阳性细胞数目增加,Caspase-3蛋白表达增加(P﹤0.05)。结论:饱和富氢液产生抗氧化、抗凋亡作用、调节炎症因子的释放,发挥对糖尿病周围神经病变产生保护作用,可能与ATP敏感性钾通道的激活相关。小结1.饱和富氢液可有效地减少高糖诱导的雪旺细胞损伤,该保护作用与饱和富氢液调控炎症反应和抗氧化应激、抗凋亡相关;2.饱和富氢液减轻大鼠糖尿病神经病变的机制,与调控炎症反应和氧化应激有关;3.饱和富氢液可通过抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用,部分逆转糖尿病引发外周神经病变,该机制与线粒体ATP敏感性钾通道的激活相关;治疗过程中均未发现毒副作用,为其临床应用提供了理论依据和实验基础。