研究背景:心源性猝死（sudden cardiac death,SCD）是造成全球人口死亡的主要原因之一。通常来说致死性室性心律失常是发生SCD的直接原因,而心肌肥厚则是引发SCD的独立危险因素之一。心肌肥厚按照病因可分为特发性心肌肥厚（肥厚性心肌病）和继发性心肌肥厚两种。肥厚性心肌病由特定的基因突变引起,而继发性心肌肥厚常由高血压、缺血性心肌病、心脏瓣膜病、感染性心肌炎、先天性心脏病及糖尿病性心肌病等引发。Ca²⁺在心肌细胞中稳定的循环是细胞正常收缩功能与电生理活动的重要保证。位于肌浆网上的钙释放通道（ryanodine receptor2,RyR2）在控制心肌细胞的Ca²⁺释放,维持细胞Ca²⁺稳态中扮演关键角色,钙调蛋白激酶II家族成员CaMK2D介导的RyR2磷酸化是RyR2通道功能调节的重要机制。CaMK2D功能增强引起的经RyR2 Ca²⁺释放增多及细胞内钙超载是心肌肥厚重构以及室性心律失常的主要病理生理改变之一。类泛素（Ubiquitin-like,UBL）蛋白家族是与泛素有着相似结构的一类小分子修饰蛋白,UBL蛋白在心血管疾病中的作用越来越受到重视。FAT10是新近发现的类泛素蛋白家族成员之一,主要功能是介导蛋白质经蛋白酶体降解,在调控细胞凋亡、周期中起重要作用。研究目的:尽管研究发现心肌细胞Ca²⁺循环异常在心肌肥厚的发生中起重要作用,然而其中的调节机制仍不明确。本研究团队首次证实FAT10在心肌中表达并具有抗心肌缺血凋亡的作用,然而,FAT10在心肌肥厚发生发展中的作用未知,本研究目的是证实FAT10是否通过调控CaMK2D-RyR2功能参与心肌肥厚,并探讨其潜在的分子机制,为将来筛查心肌肥厚的生物标记物,寻找药物干预靶点提供理论依据。研究方法:1.证实FAT10在心脏组织中的表达:分别提取大鼠、小鼠、及人的心脏组织RNA与蛋白,通过RT-PCR与Western Blot检测FAT10在心肌组织中的表达情况。2.心肌肥厚模型的构建与验证:离体实验采用100nM血管紧张素II（AngiotensinII,AngII）刺激原代心肌细胞48h诱发的心肌肥大模型。在体实验采用25周龄自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rat,SHR）形成的心肌肥厚作为动物模型。通过心脏体重比值、心肌切片HE染色从组织学上检测心脏肥厚的程度。利用荧光定量PCR分析自发性高血压大鼠心肌组织中心肌肥厚标志物ACTA1、MYH7与BNP的mRNA表达情况。3.检测FAT10在心肌肥大模型中的表达情况:离体实验部分,通过荧光定量与Western Blot检测AngII诱导的原代心肌细胞中FAT10的表达情况。在体实验部分,通过荧光定量PCR、免疫组织化学、免疫荧光与Western Blot观察FAT10在SHR大鼠左心室组织中的表达情况。此外通过检索GEO数据库中关于心肌肥厚模型的研究,提取基因表达数据,分析Fat10在其他心肌肥厚模型中的表达情况。4.观察FAT10对心肌肥大的影响:构建FAT10的过表达及干扰腺病毒,利用AngII诱导原代心肌细胞肥大模型,通过带有荧光的鬼笔环肽标记细胞中的F-actin,观察Fat10对心肌细胞表面积大小的影响。通过荧光定量PCR与Western Blot检测过表达Fat10与干扰Fat10对心肌细胞ANF与BNP合成及MYH7与ACTA1表达的影响。5.筛查FAT10潜在的作用底物蛋白:通过串联质谱筛选心肌组织中FAT10的底物蛋白并利用生物信息学分析对潜在的底物蛋白进行聚类分析。同时利用免疫共沉淀与免疫荧光在心肌中验证FAT10与CaMK2D的内源性相互作用。6.明确FAT10对CaMK2D表达与功能的调控作用:通过荧光定量PCR与Western Blot检测Fat10对CaMK2D mRNA和蛋白表达的影响并同时检测FAT10对CaMK2D下游底物RyR2在2814位丝氨酸（Ser2814）的磷酸化情况。利用CaMK2D的特异性抑制剂KN-93证实CaMK2D是否为FAT10的下游调控分子。7.明确FAT10与CaMK2D的作用特点:利用蛋白酶体抑制剂MG132观察Fat10是否影响CaMK2D的蛋白酶体降解。分别在HEK293细胞系与体外反应体系中通过免疫共沉淀与GST-pulldown验证FAT10与CaMK2D的相互作用。在HEK293细胞系中干扰FAT10的E1激活酶UBA6（ubiquitin like modifier activating enzyme 6）与E2转移酶UBE2Z（ubiquitin conjugating enzyme E2 Z）后检测FAT10与CaMK2D相互作用情况。构建CaMK2D双荧光重组质粒Camui,利用荧光共振能量转移技术观察FAT10是否影响CaMK2D分子构象,并利用Western Blot检测FAT10对CaMK2D蛋白修饰的影响。8.确定CaMK2D上与FAT10结合的区域:构建含有CaMK2D不同结构域的重组质粒,通过免疫共沉淀确定FAT10和CaMK2D结合的区域,并通过免疫荧光验证。研究结果:1.首次发现类泛素蛋白FAT10在大鼠、小鼠心脏组织中表达,并在人类心肌组织中证实FAT10的表达。2.在AngII诱导的心肌肥大模型中发现FAT10的表达下降并且下降程度依赖药物浓度。我们进一步在SHR大鼠的心肌肥厚模型中,验证了FAT10表达下降的结果。此外在GEO基因表达数据库中的两项不同心肌肥厚模型研究中,FAT10表达下降得到了再次验证。3.过表达FAT10可以改善AngII诱导的心肌细胞肥大,抑制心肌肥厚标志物ANF、BNP、MYH7与ACTN1的表达,而干扰FAT10的表达则加重心肌细胞肥大表型,增加ANF与BNP的合成并增加MHY7与ACTN1的表达。4.在心肌组织中通过串联质谱的筛选鉴定,确认了CaMK2D是FAT10的作用底物蛋白之一,并且在心肌细胞中验证了两者的相互作用。随后我们发现在心肌细胞中过表达FAT10可下调CaMK2D的蛋白表达,反之干扰FAT10的表达则上调CaMK2D的表达,说明FAT10是CaMK2D上游的负调控因子。5.在原代心肌细胞肥大模型中,过表达FAT10可显著降低RyR2 Ser2814的磷酸化水平,反之干扰FAT10则显著升高RyR2 Ser2814的磷酸化水平。说明FAT10通过CaMK2D调控了RyR2的功能。6.通过CaMK2D的特异性抑制剂KN-93,证实干扰FAT10引起的心肌肥大与RyR2 Ser2814磷酸化水平的升高依赖于CaMK2D的活性。此外我们还发现心肌肥厚减弱了FAT10与CaMK2D相互作用,提示FAT10与CaMK2D的相互作用参与心肌肥厚的形成。7.通过抑制蛋白酶体,我们发现FAT10与CaMK2D的结合并不介导其降解过程。在体内与体外FAT10与CaMK2D均可以直接作用形成蛋白复合物,不需要其他蛋白的辅助,并且不依赖E1激活酶UBA6与E2转移酶UBE2Z的表达以及FAT10蛋白C末端的双甘氨酸结构。此外我们通过荧光共振能量转移法发现FAT10能在不影响蛋白的自身磷酸化与氧基化修饰的情况下改变CaMK2D的分子构象。8.成功构建CaMK2D片段化的重组质粒后,我们通过免疫共沉淀与免疫荧光确认CaMK2D分子与FAT10相互作用的区域在其蛋白N端的催化结构域内。结论:1.首次揭示类泛素蛋白FAT10在心脏中表达,并在心肌肥厚中表达下降。2.FAT10具有减轻心肌肥厚的作用。3.首次证实CaMK2D是FAT10在心肌细胞中的作用底物蛋白。4.通过下调CaMK2D的表达与功能进而降低RyR2磷酸化是FAT10改善心肌肥厚表型的分子机制。5.FAT10与CaMK2D的非共价结合属于蛋白间直接相互作用,与蛋白降解功能无关,并且不依赖FAT10的E1酶与E2酶的参与。6.FAT10与CaMK2D的催化结构域结合,并且在不改变CaMK2D蛋白翻译后修饰的情况下,影响CaMK2D的分子构象。综上所述,我们发现FAT10是一个具有改善心肌肥厚作用的类泛素蛋白。