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天冬氨酸激酶（AK）是催化天冬氨酸族氨基酸生物合成途径的关键酶,其活性受Lys和Thr协同反馈抑制作用,调控整个代谢途径的碳流量,从而限制产物的过量积累,因此变构抑制的解除是设计和优化代谢途径的巨大挑战。本研究以北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）天冬氨酸激酶（CpAK）为研究对象,通过定点饱和突变和高通量筛选技术成功获得酶学性质显著改善的7种AK突变体。对野生型（WT）和突变体AK分别进行酶促动力学和酶学性质研究,利用分子动力学模拟进一步探讨了酶催化活性显著提高的作用机制,并利用电转化法将高酶活力的突变体AK转入到北京棒杆菌原菌中,成功构建了2株工程菌。结果如下:1.通过同源比对和结构网格分析发现CpAK M372、T379和E400位点是抑制剂Lys结合口袋中的关键残基且高度保守,因此本研究对以上3个位点进行分子改造,试图削弱Lys结合口袋残基与抑制剂Lys的结合,从而解除Lys对AK的反馈抑制作用。2.经突变PCR扩增、转化、高通量筛选等步骤成功获得7种AK酶学性质显著改善的突变体,分别为M372I、T379W、T379S、E400A、M372I/E400A、M372I/T379S和M372I/T379W。通过SDS-PAGE和Western blot验证表明突变体AK在大肠杆菌中实现了高效表达。3.WT AK和突变体AK分别进行酶促动力学及酶学特性研究,结果表明:与WT AK的最大反应速率Vmax 2.78 U/mg·min-1相比,突变体的Vmax均提高,其中双突变体M372I/T379S和M372I/T379W分别提高了15.60和17.68倍;突变体M372I/E400A与M372I/T379W表现出良好的耐热性,均由28℃升至35℃;除突变体M372I/T379W AK外,其余突变体AK最适pH均有小幅度升高,其中M372I/E400A和M372I/T379W耐受pH范围更广,分别在7.5-9.5和6.5-9.0 pH范围内保持相对酶活力50%以上;突变体AK与WT AK相比更稳定,尤其是突变体M372I/E400A、M372I/T379S和M372I/T379W表现为更好的稳定性,较WT AK半衰期分别延长了1.3、2.3、1.2 h。4.WT AK酶活力受抑制剂Lys和Thr的反馈抑制作用,当浓度为5和10 mmol/L时,受Lys与Thr二者协同抑制最显著。与WT AK相比,在0.2-10 mmol/L浓度范围内,突变体T379S、M372I/T379S、T379W和M372I/T379W均有不同程度解除Lys的反馈抑制作用,特别是抑制剂Lys单独存在时,随着Lys浓度增大,AK激活作用越显著,呈现出剂量依赖关系。经微量热泳动分析结果显示M372I/T379W AK不仅削弱了抑制剂Lys的反馈抑制作用,还增强了其与底物Asp的结合强度。5.分子动力学模拟结果表明,M372I和T379W突变后引起了整个蛋白质的回转半径Rg和溶剂可及表面积SASA显著增大,以及ATP/Asp结合口袋附近残基的结构重排。M372I/T379W AK残基簇Leu288-Gly363和Lys364-Ala418之间的角度从107.9°降至93.1°,使得AK由闭合状态转为开放状态。M372I/T379W AK与ATP及Asp之间的氢键占有率增多,并且Asp结合口袋入口门Arg169-Ala60距离由9.6?增至15.1?,使得空间位阻消失,促进了AK与底物Asp结合,从而提高了AK催化效率。6.通过电转化法成功构建了M372I/T379S和M372I/T379W工程菌株,并进行发酵分析。工程菌M372I/T379S和M372I/T379W发酵液中总氨基酸含量高达53.64 g/L和57.88g/L,较北京棒杆菌原菌分别增长了4.92 g/L和9.16 g/L。