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目的:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)发病率和死亡率居各种疾病前列,严重地威胁着人类的健康和生命,探讨其发病机制对于AS的防治具有重要的临床意义和必要性。巨噬细胞作为形成AS中的重要因素,是目前预防和治疗AS的重要靶点。探究有效的方法使得具有促炎作用的M1型巨噬细胞转化为具有抗炎作用的M2型巨噬细胞,成为了预防和治疗AS的重要研究方向。木犀草素(Luteolin,Lut)可通过PI3K/Akt通道发挥心肌保护作用,近期研究发现Lut具有很强的抗AS作用。因此,本研究以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象,通过血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)诱导巨噬细胞凋亡,以PI3K/Akt通路抑制剂LY294002为对照,探讨Lut对巨噬细胞表型的影响及其对巨噬细胞凋亡的作用,观察Lut对PI3K/Akt通道的作用及其与巨噬细胞表型转化、凋亡之间的关系,为Lut预防和治疗动脉粥样硬化性疾病提供理论和实验依据。方法:研究对象为健康雌性成年C57BL/6J小鼠,体重20-25g,8周龄,清洁级。1.小鼠腹腔巨噬细胞原代细胞培养及鉴定:对小鼠腹腔巨噬细胞进行原代细胞培养,通过细胞形态学观察及CD68免疫荧光鉴定巨噬细胞表面特征性标征判断巨噬细胞原代培养情况。选用浓度分别为6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM的Lut作用于巨噬细胞,通过CCK8法和乳酸脱氢酶检测(lactate dehydrogenase LDH)明确Lut对小鼠腹腔巨噬细胞活力和毒性的影响,观察Lut的最佳作用浓度。2.观察Lut对AngⅡ诱导的巨噬细胞凋亡及表型转化的影响:实验分组包括空白对照组、AngⅡ组(AngⅡ1μ M预处理12小时)、AngⅡ+Lut 组(Lut 预处理12 小时后 AngⅡ1 μM 12 小时)、Ang Ⅱ+LY(LY294002)组(LY50μ M预处理1小时后AngⅡ1μ M 12小时)、Ang Ⅱ+Lut+LY组(LY预处理1小时、Lut预处理12小时后AngⅡ1 μM 12小时)。观察指标包括:(1)巨噬细胞凋亡情况:采用Annexin V/PI检测细胞凋亡比率,Western blot检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3。(2)巨噬细胞表型转化情况:采用流式细胞仪和ELISA法检测巨噬细胞表型分子标记物。3.Lut对Akt蛋白的作用特点(包括剂量及时间特点):实验分组包括空白对照组、AngⅡ组(AngⅡ1μM预处理12小时)、AngⅡ+LY(LY294002)组(LY50μ M预处理1小时后AngⅡ1 μM 12小时)、Ang Ⅱ+Lut不同时间干预组(以Lut25μM预处理3小时、9小时、12小时后Ang Ⅱ1μM 12小时)、Ang Ⅱ+Lut不同剂量干预组(Lut6.25μM、12.5μM、25μM预处理12小时后AngⅡ1μM12小时),利用Western blot检测Akt、p-Akt308、p-Akt473蛋白表达水平。采用GraphPad Prism 5.0统计分析软件分析实验数据,计量资料以均数±标准误表示(mean±S.E.M.),两两比较采用q检验,多组间比较采用单因素方差分析或两因素方差分析(one-way ANOVA or two-way ANOVA),按α=0.05的检验水准,P<0.05认为有统计学意义。结果:1.巨噬细胞原代培养结果:倒置显微镜下可见原代培养的巨噬细胞生长良好,激光共聚焦显微镜观察可见成熟的巨噬细胞表面活性标记物CD68的阳性率大于99%,提示巨噬细胞原代培养成功,可用于实验。2.CCK-8法及LDH检测不同药物浓度Lut的毒性试验:与对照组(Lut0μM)相比,从6.25μM到25μM浓度的Lut作用12h对细胞活力均无明显影响,而从50μM浓度Lut处理组细胞活力明显下降(P<0.001);与对照组比较,Lut 50μM浓度组LDH含量明显增加(P<0.05)。故选用25μM浓度的Lut对巨噬细胞进行干预。3.巨噬细胞凋亡情况:Annexin V/PI检测提示与Ang Ⅱ组相比,Lut预处理组及LY预处理组均减少Ang Ⅱ刺激引起的巨噬细胞凋亡比率(P<0.001),且Lut组效果显著强于LY组(P<0.01);但与Lut组比较,Lut+LY组的效果未见增强(P>0.05)。Westernbolt检测提示与Ang Ⅱ组相比,Lut预处理组及LY预处理组Bcl-2和caspase-3蛋白水平显著上调(P<0.001),Bax和cleavedcaspase-3蛋白水平显著下调(P<0.001),且Lut组效果显著强于LY组(P<0.01);但与Lut组比较,Lut+LY组的效果未见增强(P>0.05)。4.巨噬细胞表型转化情况:ELISA检测提示与Ang Ⅱ组相比,Lut预处理组及LY预处理组M1巨噬细胞分子标志(ⅡL-6,TNF-α,iNOS,CD16/32)表达显著减少(P<0.001),M2巨噬细胞分子标志(Dectin-1,IL-10,Arg-1,CD206)表达显著增加(P<0.001),且Lut组效果显著强于LY组(P<0.01);但与Lut组比较,Lut+LY组的效果未见增强(P>0.05)。流式细胞仪检测提示与Ang Ⅱ组相比,Lut预处理组及LY预处理组M1型巨噬细胞(CD16/32细胞)显著减少(P<0.001),M2型巨噬细胞(CD206细胞)显著增多(P<0.001),且Lut组效果显著强于LY组(P<0.01);但与Lut组比较,Lut+LY组的效果未见增强(P>0.05)。5.Lut对Akt蛋白的作用特点:Western Blot检测提示,与Ang Ⅱ组相比,LY组显著抑制p-Akt(308)和p-Akt(473)表达(P<0.001)。Lut25μM预处理3小时组、9小时组、12小时组对p-Akt(308)和p-Akt(473)水平的抑制较Ang Ⅱ组、LY组均有统计学意义(P<0.05),且抑制效应随着时间延长逐渐增强,不同时间组对p-Akt(473)水平的抑制均有统计学意义(P<0.05),但Lut3小时组、9小时组对p-Akt(308)的抑制无统计学意义(P>0.05),Lut12小时组对p-Akt(308)的抑制显著强于 3 小时组、9 小时组(P<0.05)。Lut6.25μM、12.5μM、25μ M预处理组对p-Akt(308)和p-Akt(473)水平的抑制较Ang Ⅱ组、LY组均有统计学意义(P<0.05),且抑制效应随着剂量增加逐渐增强,不同剂量组对p-Akt(473)水平的抑制均有统计学意义(P<0.05),但Lut6.25μM、12.5μM组对p-Akt(308)的抑制无统计学意义(P>0.05),Lut25μM 组对 p-Akt(308)的抑制显著强于 6.25uM、12.5μM 组(P<0.05)。结论:1.Lut预处理能够调控巨噬细胞表型转化,由促炎作用的M1型向抗炎作用的M2型转化,并抑制巨噬细胞的凋亡。2.Lut可部分通过抑制PI3k/Akt信号通路发挥其抑制巨噬细胞凋亡的作用,其对PI3k/Akt信号通路的抑制作用具有时间依赖和剂量依赖的特点,且Lut对Akt蛋白Ser473位点的作用较Thr308位点更为典型。