肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属成员,是儿童手足口病和疱疹性咽峡炎的主要病原体之一。患者通常症状轻微,但少数病例可伴有严重的神经系统并发症,包括无菌性脑炎、脑干脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿等,导致终生后遗症甚至死亡。近几十年,EV71在亚太地区广泛传播,严重威胁儿童的健康,已成为该地区继脊髓灰质炎病毒之后最重要的肠道病毒病原体。自1989年首次发现以来,EV71病毒已在我国大陆地区流行超过二十年时间。1990-2000年代早期,EV71主要在国内南方省份散发流行。2007-2008年,山东和安徽地区突然暴发EV71引起的手足口病,导致严重的临床后果以及几十例儿童死亡。基于这种形势,我国于2008年5月2日将手足口病纳入丙类法定报告传染病。随后的加强监测结果表明,手足口病已在我国广泛流行,并且大部分重症病例为EV71病毒感染。根据病毒的遗传差异,EV71可以被分为A、B、C三种基因型,后两种可进一步被分为B1-5和C1-5基因亚型。病原学监测发现,我国大陆地区流行的EV71病毒长期以来均为C4基因亚型。但约在2003-4年间,一种新的不同于先前C4b lineage(进化分支)的C4a lineage病毒在大陆地区出现,并造成近几年手足口病的大规模流行。和C4b相比,C4a传播的地域广且持续时间长,因此,C4a似乎有更强的传播能力。回顾性调查表明,自然因素、人群的行为和遗传背景可能影响HFMD的流行,但C4a病毒传播能力增强的机制尚不清楚。由于病毒生物学特征可决定疾病的临床表现、严重程度以及疾病流行强度,因此对上述两种lineage病毒间差异以及差异所导致的病毒生物学特征改变进行调查,能够对病毒致病性的分子机制提供新的理解,同时能对疾病防控有所裨益。本研究测定了22株2003-2013年间福建省分离的EV71病毒基因组,结合1998-2013年大陆地区其他省份48株病毒基因组序列,进化分析发现,所有的病毒可以分为C4b和C4a两种lineage,但病毒多聚蛋白(polyprotein)存在13个氨基酸突变。本研究将其中位于VP1蛋白22位的组氨酸→谷氨酰胺(H22Q)和3D蛋白的赖氨酸→精氨酸(K140R)突变引入EV71病毒感染性克隆pcrXL149-08中,并从转染细胞中获得克隆衍生病毒(clone derived virus,CDV)。病毒感染RD细胞72小时后,应用本研究建立的适时荧光反转录PCR方法测定的滴度结果表明,具有VP1/22H的CDV滴度较VP1/22Q高。一步感染试验也表明,在病毒感染的早期,具有VP1/22H突变的CDV可更多地吸附于宿主细胞。转染人清道夫受体B2(hSCARB2)基因的293T细胞吸附试验表明,2VP1/22H CDV较VP1/22Q CDV具有更高的宿主细胞吸附能力,而3D/K140R对病毒的复制则无影响。免疫沉淀结果也表明,细胞表面受体hSCARB2与VP1/22H CDV具有更强的结合能力。本研究的主要发现包括:1.两种lineage C4基因亚型EV71病毒的多聚蛋白存在13个氨基酸突变,这些突变在两种C4 lineage病毒中的分布有显著差异;2.VP1蛋白22位组氨酸(H)→谷氨酰胺(Q)突变导致C4基因亚型病毒对宿主细胞吸附能力下降;3.3D蛋白140位赖氨酸(K)→精酰胺(R)突变对C4基因亚型病毒复制无影响;综上,本研究发现C4亚型病毒VP1/22位组氨酸→谷氨酰胺突变导致病毒与细胞表面hSCARB2受体吸附能力下降,由于C4a在VP1的22位H,而C4b对应的残基则为Q,因此上述发现可能有助于解释为何C4a较C4b具有更强的传播能力的原因。