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禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)根据其致病性可分为高致病性禽流感(HPAI)和低致病性禽流感(LPAI)病毒,通常HPAIV对家禽表现为高致死率,而LPAIV对家禽的致病表现为从无症状到轻微症状,但是传播范围广,常常导致混合感染而使死亡率上升。当前流行的禽流感病毒主要包括H5、H7和H9亚型,可以跨种间传播,甚至传播给人,对公共卫生产生巨大威胁。疫苗接种是预防流感大流行的主要策略,目前大多数季节性流感疫苗都是用鸡胚生产,需要大量的人力和物力,在大流行期间很难放大生产,如果爆发高致病性禽流感(HPAI)病毒(如H5N6、H7N9病毒),很难在短时间大量供应SPF鸡胚。目前有多个细胞系可以用于繁殖流感病毒,常用的有MDCK、Vero细胞等,其培养过程简单、增殖迅速、病毒产量高。然而MDCK细胞培养也面临两方面的问题:一是MDCK细胞贴壁性太强,无法适应工业化生产;二是与鸡胚培养相比,禽流感病毒在细胞上的繁殖能力不高。有研究通过对细胞进行修饰,改变其生物学特性来解决上述问题。研究表明TIGAR(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator)基因能够减少各种应激引起的凋亡,提高细胞存活时间。唾液酸转移酶(siat7e)基因是控制细胞贴壁程度的重要基因之一,β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶(ST3GAL4)基因编码的产物能提高宿主细胞对禽流感病毒的敏感性。实验室前期已经构建了稳定表达TIGAR基因的MDCK细胞(TG-418-E5),和稳定共表达Siat7e基因和ST3GAL4基因的MDCK细胞(M54),因此,本研究通过对两个修饰的MDCK细胞进行驯化,使之适应无血清全悬浮培养,并用于增殖禽流感病毒。1、TG-418-E5细胞和MDCK-siat7e-ST3GAL4(M54)细胞悬浮培养的驯化在细胞没有悬浮驯化的情况下,先使用微载体来悬浮培养TG-418-E5细胞,分析初始细胞接种密度、微载体浓度和换液方式对细胞生长的影响,以确定在使用微载体悬浮培养时的最佳的培养条件,同时分析降低培养基中血清浓度对细胞状态的影响。研究表明TG-418-E5细胞在微载体悬浮培养的情况下,当微载体浓度为3 g/L、细胞初始接种密度为30×104/mL时,培养48h进行半换液、72h进行全换液,96h活细胞密度(viable cell density,VCD)可达310 × 104个/mL以上。与母本MDCK细胞相比,在含有5%血清培养基或低血清培养条件下,TG-418-E5细胞在微载体上的最大活细胞的密度高了将近23.5%(约40×104个细胞),但是在降血清过程中,两种细胞都出现拉丝,细胞轮廓不清晰,生长比较缓慢等情况,因此都不适合进行无血清驯化。M54细胞是进行贴壁性能修饰的MDCK细胞,通过单细胞悬浮驯化、逐渐降低血清浓度的方法,获得一个悬浮细胞株M54x。我们比较了 M54x不同细胞初始密度对活细胞数和细胞上清中的葡萄糖、乳酸浓度的影响。结果表明M54x细胞的最佳接种初始密度是60×104cells/mL,细胞生长密度最高,生长速率最快,细胞上清中葡萄糖浓度较高而乳酸浓度较低,细胞高峰密度可达到420×104cells/mL。而在72h,细胞处于对数生长期,细胞状态较好,72h之后细胞上清中葡萄糖浓度较低而乳酸浓度越来越高,所以72h是一个临界点,细胞上清中葡萄糖浓度和乳酸浓度不会影响病毒增殖,因此72h是病毒最佳接种时间。由于微载体的使用大大增加成本,最经济实用安全的方法是低血清悬浮培养,因此选择M54x细胞做低血清悬浮培养驯化是更好的选择。2、TG-418-E5细胞与M54悬浮细胞用于增殖禽流感病毒的初步探究本研究中利用摇瓶培养系统和BIOSTATA生物反应器,比较了H5亚型YA-5、R2344和H7N9 rGW三个禽流感疫苗候选株在这两种细胞上的生长情况,确定病毒在不同培养体系的最佳接种时间、接种量、最佳胰酶浓度和最佳收获时间。TG-418-E5细胞用微载体最佳条件培养,培养后72h病毒HA效价达到最高值;与MDCK细胞相比,病毒HA效价提高了 1-2个滴度,但是该细胞利用微载体悬浮培养无法适应低血清悬浮培养,因此未做放大培养研究。我们在摇瓶中无血清悬浮培养M54x细胞,分别比较不同的MOI、TPCK-胰酶浓度和温度对禽流感病毒增殖的影响,发现33℃培养、MOI为0.0001、TPCK-胰酶浓度为5μg/mL是最佳病毒感染条件。将3种禽流感疫苗株(H5亚型YA-5、R2344和H7亚型rGW)接种M54x悬浮细胞,72～96h后收获病毒,病毒血凝效价HA分别可达9、8、9log2/50μL。在BIOSTAT A反应器培养体系中,初步探索M54x细胞繁殖禽流感病毒的工艺参数:培养72h后半换液,加入TPCK-胰酶至终浓度为5μg/mL,按0.0001 MOI接种3种禽流感疫苗株(H5亚型YA-5、R2344和H7亚型rGW),同时设定生物反应器各项参数。病毒培养72h～96h之间收获(每6h取样观察病变、测上清HA效价)产量最高。H5亚型YA-5在76h收获,HA效价可达91og2/50μL;H5亚型r2344在66h收获,HA效价为91og2/50μL;H7亚型rGW在72h收获,HA效价是91og2/50μL。这个结果说明M54x细胞系具有无血清悬浮培养生产禽流感病毒疫苗的潜能。本试验成功建立了 M54x悬浮细胞系并且能够稳定高效繁殖禽流感病毒,为禽流感疫苗生产中采用无血清无蛋白、无动物源性培养基,生物反应器规模化培养M54x细胞生产禽流感病毒提供了一定的实验依据。