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多发性骨髓瘤(Multiple myeloma, MM)是最为常见的血液系统恶性肿瘤之一,发生率占血液系统恶性肿瘤的10%左右。随着我国人口老龄化趋势日益加剧,该病的发生率在我国呈逐年增高的趋势。蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib)能够通过细胞凋亡抑制MM细胞生长,在MM的治疗中显示出了较好的疗效。然而,随着其临床应用范围的扩大和时间的推移,国内外临床研究已发现,部分MM患者对硼替佐米产生了耐药反应,或在初期治疗有效的MM患者中出现耐药及疾病的复发,从而影响了硼替佐米的疗效。因此,揭示MM对硼替佐米的可能的耐药机制将具有非常重要的临床意义。我们在前期比较了对硼替佐米有效的骨髓瘤病人和对硼替佐米无效的骨髓瘤病人,基因芯片分析发现,CD9基因在对硼替佐米无效的的病人中下降的最明显。为了进一步深入探讨CD9在硼替佐米治疗多发性骨髓瘤中可能发挥的作用,我们进行了本课题的研究。本研究将分析MM细胞株中CD9基因表达情况与基因启动子甲基化的相关性；通过分子生物学技术进一步阐明了CD9影响硼替佐米抑制骨髓瘤细胞增殖及相关机制的研究。方法采用半定量RT-PCR检测9种不同的MM细胞株CD9mRNA的表达水平；甲基化特异PCR(MSP)及亚硫酸氢盐-基因组测序法(BGS)检测不同MM细胞株启动子甲基化情况对不同MM细胞株进行了5-Aza-DC去甲基化处理,RT-PCR检测药物处理前后CD9基因mRNA表达情况；用IC50浓度检测不同CD9表达的MM细胞株对硼替佐米的药物敏感性；分别用去甲基化药物5-Aza-DC和硼替佐米以及两者联合作用于MM细胞株,MTS检测MM细胞株增殖的影响；通过慢病毒转染,获得稳定表达CD9的MM细胞株,硼替佐米作用于稳定转染CD9的MM细胞株,MTS、流式细胞术检测药物对MM细胞增殖及凋亡的影响；最后采用基因芯片技术初步探讨CD9影响硼替佐米对MM细胞增殖作用的机制。结果在9种不同的MM细胞株中的CD9表达水平高低不一,其中ARK、MM.1S. RPMI8226和OPM2细胞呈高表达,CAG细胞呈低表达,而U266、ARP-1、NCI-H929和DAN细胞几乎不表达；在低表达或沉默表达的2个骨髓瘤细胞株(H929和U266)中,经启动子去甲基化药物(5-aza-DC)处理后CD9基因的mRNA表达水平恢复或增强；MSP检测发现CD9基因启动子在5个低表达CD9的骨髓瘤细胞株(U266、ARP-1、H929、CAG、DAN)中出现全部甲基化或部分高甲基化。BGS测序结果与MSP检测基本相一致；CD9低表达或沉默表达的2个骨髓瘤细胞株U266和H929对硼替佐米的IC50分别为20.9nM和18.5nM, CD9高表达的2个骨髓瘤细胞株8226和MM.1S对硼替佐米的IC50分别为5nM,6.2nM;分别用(5-aza-DC)和硼替佐米或者两者联合作用于骨髓瘤细胞株U266和H929,MTS结果显示硼替佐米组和联合用药组相比于对照组能够明显抑制MM细胞的增殖(p<0.05),且联合用药组对MM细胞增殖抑制的作用明显优于硼替佐米组(p<0.05)；硼替佐米作用于稳定转染CD9基因的MM细胞株U266,发现与空载组相比硼替佐米能明显抑制MM细胞的增殖(p<0.05),促进其凋亡(p<0.05)。利用基因表达谱芯片技术检测包括人类肿瘤发生相关的多功能基因的变化情况,共发现298个表达差异明显的基因,其中上调基因有113个,下调基因有185个。结合Pathway分析发现CD9明显上调了3条信号通路,明显下调了5条信号通路。结论CD9是一个受表观遗传学调控的基因,其在多发性骨髓瘤中的表达下调与基因启动子DNA甲基化密切相关；去甲基化药物(5-aza-DC)与硼替佐米对骨髓瘤细胞的增殖具有协同抑制作用,其机制可能是(5-aza-DC)恢复了骨髓瘤细胞中CD9的表达,进一步的研究发现CD9可能是通过影响内质网蛋白折叠信号通路和NK-κB信号通路来影响硼替佐米对骨髓瘤细胞增殖的抑制作用。