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MYB转录因子广泛分布于真核生物中,是植物最大的转录因子家族之一。广泛参与植物生长发育全过程,如次生代谢调控、激素和环境因子的应答,对细胞分化、形态建成等具有重要的调控作用。类黄酮代谢途径是苯丙烷类代谢途径的一个主要分支,其产物具有多种生物学功能,在植物基础生理代谢中发挥极为重要的作用。由于其广泛的生物学活性和药理功能而日益受到人们的重视,被认为是一类极富医疗和保健价值的天然物质,具有广泛的开发前景。大豆是重要的油料作物,也是蛋白和类黄酮的重要来源。因此,克隆大豆中参与类黄酮代谢调控的转录因子基因、研究它们的调控机制具有重要的学术意义和广阔的应用前景。当前,很多植物基因组测序相继完成,为我们提供了丰富的基因组信息。使通过比较基因组学、生物信息学和功能基因组学相结合,在基因组水平解析MYB转录因子家族的分子进化机制成为可能。本课题以MYB转录因子广泛参与调控类黄酮生物合成为切入点,结合生物信息学和比较基因组学的方法,详细解析了MYB类转录因子家族和类黄酮代谢途径的分子进化机制；阐明了MYB基因的功能分化机制等。通过系统进化树分析、表达谱分析、共线性分析、共表达分析等方法相结合,预测亚家族的功能,筛选在进化过程中保守的、参与调控类黄酮生物合成的MYB基因；并通过实验验证候选基因的功能。主要研究结果如下：1.详细解析了2R-MYB转录因子基因家族在真核生物,特别是陆生植物的分子进化机制。结果表明：(1)2R-MYB基因广泛分布于真核生物界,说明该基因家族非常古老；(2)2R-MYB基因家族在陆生植物,特别是被子植物基因组中进行了大量的扩增,基因数量非常庞大；主要扩增机制是染色体片段复制和串联复制；(3)系统进化树分析表明,2R-MYB基因家族是单源的、可划分为56个亚家族；其中6个亚家族较古老,存在于陆生植物早期,在进化过程中基因结构和数量均非常保守；发现多个单、双子植物特异的家族,说明该基因家族在进化过程中形成了新的物种特异的功能,以适应新的环境条件；(4)分子进化分析表明,2R-MYB基因的MYB结构域主要为纯化选择,没有发现正选择的位点；基因功能分化的主要机制是DNA结合域的R2和R3重复区的第一个螺旋区发生松散选择(relax selection)所致。(5)亚家族内基因结构、内含子插入位点等均非常保守,证明亚家族成员的功能保守。2.我们分析了MYB-related (1R-MYB)类MYB基因家族在16个植物基因组中的分子进化机制(包括红藻、绿藻、藓、卷柏、单子叶植物和双子叶植物)。(1)结果显示,在被子植物中发现了大量的MYB-related基因；而低等植物,特别是藻中则非常少；(2)系统进化树分析可以将这个家族划分为五个高度保守的亚家族,包括：CCA1-like/R-R、TBP-like、CPC-like、I-box-like和TRF-like;(3)各亚家族的结构非常保守。其中CCA1-like亚家族的MYB重复区均含有一个保守的氨基酸基序(SHAQK(Y/F)F);同理TBP亚家族也含有一个LKDKW(R/K)(N/T)基序；(4)系统进化树分析显示,CCA1-like/R-R和TBP-like亚家族最古老,都含有红藻的同源基因；而CPC-like和I-box-like亚家族则是在被子植物中才形成的；其中,CPC-like是从2R-MYB基因来的R3重复区域演化而来,I-box-like则是从R-R类型的第一个MYB重复区域演化而来；TRF-like亚家族数量最非常少,说明它们在进化过程中非常保守。(5)和2R-MYB相似,MYB-related类型的MYB结构域主要为纯化选择,没有发现阳性选择的位点。表达分析显示,MYB-related基因在大豆和玉米基因组中的表达谱广泛,证明它们可能参与植物生长发育全过程。(6)该类基因在陆生植物界主要经历了三次扩增,且MYB结构域有明显的漂移情况。3.重点解析了2R-MYB基因在单子叶植物玉米和双子叶植物大豆基因组中的分布规律、结构特征和表达模式等。证明该基因家族在玉米和大豆所有染色体上均有分布,且主要分布在染色体的两端；亚家族内的基因结构,如MYB结构域、内含子插入位点和时期、外显子长度、核酸和蛋白结构等均高度保守；2R-MYB基因在大豆和玉米基因组中表达谱广泛,暗示该基因家族可能参与植物生长发育的全过程,对植物生长发育具有重要的调控作用。4.全面解析了类黄酮代谢调控途径在陆生植物中的分子进化机制。(1)发现苯丙烷类代谢途径的酶基因PAL等在陆地植物早期就已存在,说明苯丙烷类代谢途径起源较早；而类黄酮、花青素等分支途径的关键酶基因则起源于被子植物。(2)在已测序的24个植物基因组中,异黄酮合成酶(CYP93C)基因只在豆科植物中有分布,暗示异黄酮类物质可能是豆科植物特异的(或主要分布于豆科植物)；分子进化分析显不CYP93C基因是近期在豆科植物中从CYP93B亚家族演化而来；其功能分化的机制可能是因为其N端的跨膜区和中间的链接区发生少数的正选择,使蛋白的空间结构发生一定的变化进而导致酶识别的底物改变。(3)系统进化树分析显示,参与调控类黄酮代谢途径的MYB亚家族在进化过程中非常保守,且这些亚家族的起源与类黄酮代谢途径相关酶基因保持一致,证明MYB基因与类黄酮代谢途径存在协同进化机制。5.对GmMYB042/Z2基因的功能进行了详细研究,重点研究其在类黄酮代谢调控途径中的作用。主要研究内容和结果：(1)对GmMYB042进行了表达特性分析、原核表达分析、转录激活活性分析等；(2)将GmMYB042基因在烟草中进行了过表达。证明了该基因的导入导致转基因烟草类黄酮代谢途径部分关键酶基因(如PAL、CHS和FLS)的表达量明显上升；转基因烟草总黄酮含量显著高于对照。(3)GmMYB042的C端含有一个保守氨基酸基序(PDLNLELTIS)和锌指结构；酵母单杂交实验证明该基序对目的蛋白的转录活性有明显的抑制作用；(4)构建了各缺失突变体的高效植物表达载体,并在模式植物烟草中过表达。结果显示缺失突变体转基因烟草类黄酮代谢途径相应的关键酶基因的表达有规律地变化,进一步证明目的基因调控类黄酮化合物的合成；(5)转基因烟草叶型有明显变化,突变体的叶缘有明显的邹缩。(6)克隆了GmMYB042基因的启动子序列,通过缺失突变分析明确了其转录起始位点等。