石墨烯量子点(GQDs)作为一种具有良好发光性能的新型碳基纳米材料,因其一系列优异的理化性能及良好的生物兼容性,在生物医学领域有着广泛的应用前景。本研究利用自下而上的水热法设计合成一种高荧光,生物相容性好的石墨烯结构的肿瘤细胞核靶向纳米荧光探针(graphene-based tumor cell nuclear targeting fluorescent nanoprobe,GTTN),磺酸基官能团化石墨烯量子点,用于肿瘤区域智能精准靶向。合成的GTTN是一种两亲性单晶石墨烯结构荧光探针材料,表面被磺酸基和羟基官能团化。GTTN具有灵敏的肿瘤细胞核特异靶向性能,不需要额外的生物配体修饰,在体内可以特异地从肿瘤细胞膜上渗透进入细胞,直接靶向肿瘤组织细胞核;而在正常组织内摄取率极低。GTTN具有普适性、灵敏性和精准性,广泛适用于多种肿瘤类型;可以在早期阶段识别检测肿瘤病灶区域,并跟踪肿瘤细胞的侵袭和转移。具体机理探讨,首先在体外模拟肿瘤组织微环境内间质液体量极少和高间质液压(IFP)的这两个特性,通过水浴或激光加热来逐步减薄细胞表面的培养基液面,液体表面张力增加,形成超薄液膜后,促使GTTN与细胞膜紧密接触。在高压条件下,小粒径GTTN逐渐渗透进入细胞膜,触发进核现象。分子动力学模拟结果发现,带负电荷的磺酸基官能团促使GTTN在穿膜过程中,具有自清洁功能,保持足够小的尺寸来实现穿过核膜进入细胞核聚集。研究表明,GTTN的肿瘤细胞核靶向机制与其小粒径、负电荷表面、肿瘤特殊微环境(间质液体量少、IFP高)和自清洁作用等密切相关。GTTN非常适用于肿瘤特异性成像和治疗,为肿瘤诊断和治疗提供了一个全新的思路。此外,为确保其安全使用,在体内外系统研究带正电荷的GTTN的毒性及产生机理,并用本课题组之前合成的相类似结构的带正电荷的氨基官能团化石墨烯量子点(Amino-GQDs)作为对比参照。两种材料皆显示良好的化学和光学稳定性,体外体内成像和毒理学研究结果表明,表面电荷的不同导致两种GQDs不同的亚细胞器定位和毒理学特性。带正电荷的Amino-GQDs容易通过细胞膜并在细胞质中聚集;而带负电荷的GTTN在正常培养条件下与细胞共孵育48 h后,也不通过细胞膜进入细胞,其原因在于与细胞膜之间存在的静电斥力。两种GQDs皆显示良好的体内外荧光成像性能,但Amino-GQDs在体内显示急剧毒性,导致小鼠死亡,局限了其临床应用。相反,GTTN显示出对肿瘤细胞核的特异性靶向,且在体内和外都没有显著毒性,生物相容性极佳。研究表明了GTTN在临床应用上的巨大潜力,为功能化GQDs在临床肿瘤诊断和治疗中的安全应用提供了非常基础而全面的依据。另一方面,目前在生物医学诊断方面,双光子显微镜可对生物组织样品进行更深层全面成像研究,且光损伤更小,其光学应用前景逐渐被人发现并广泛研究。GTTN在双光子激发下表现出强荧光,非常适用于细胞和深部组织双光子成像。此外,GTTN光漂白性小,毒性低,并且可以在很宽的pH值范围内发出相当强的荧光。使用近红外飞秒激光作为激发光源,系统地研究了 GTTN双光子诱导的荧光,并将其应用于体外和体内有效的检测和深部肿瘤组织成像。与共聚焦显微镜下结果类似,双光子显微镜下同样观察到GTTN的负电荷表面与细胞膜之间的静电斥力使其优先在细胞膜外停留;且细胞核靶向过程在超薄液膜条件下启动。此外,GTTN显示出体内肿瘤细胞核的能力,适用于多种肿瘤类型,以及人体肿瘤模型,而在正常组织中不被细胞摄取。在双光子荧光显微镜下的组织穿透深度研究中,GTTN的荧光在500 μm深度下都可以被检测到,穿透深度很高。综上,GTTN具有良好的双光子诱导荧光特性,可以作为一种优异的双光子荧光探针,应用于深层肿瘤检测与监控。总之,GTTN生物相容性好、荧光强、智能靶向肿瘤区域、双光子荧光特性优异等优势,使其在生物医学领域有着良好的应用前景。