并行STED中光学参数对荧光擦除图案影响的研究

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受激发射损耗(Stimulated Emission Depletion,STED)显微镜是一种重要的超分辨成像工具,但传统STED显微镜的点扫描成像方式导致成像速度较慢,难以满足许多生命科学研究的需要。并行STED显微术采用周期性排列的多个面包光圈或光学格子作为荧光擦除图案并行实现多点荧光擦除,可有效地提升显微成像速度。与多面包光圈阵列相比光学格子可以构建出较大规模的并行荧光擦除图案,对STED显微成像速度提升明显。根据STED成像原理,多光束干涉产生的光学格子(并行荧光擦除图案)中相邻亮条纹间距(并行荧光擦除图案周期)越小成像分辨率越高。已报道文献中利用平面波模拟高斯光波,研究了参与干涉的损耗光束数量、损耗光束的偏振态和样本平面焦点处损耗光束的传播方向对并行荧光擦除图案周期的影响,发现样本平面焦点处轴对称传播的损耗光束与光轴间夹角越大并行荧光擦除图案周期越小。焦点处损耗光束与光轴间夹角由辅助物镜及显微物镜组成的并行STED显微成像系统决定,但这些文献中尚未阐明并行STED显微成像系统光学参数对并行荧光擦除图案周期的影响。因此本文针对这个问题开展研究,首先分析已报道四光束干涉并行STED显微镜的光路装置,建立并行STED显微成像系统的理想光学系统模型。在此模型下,推导出受辅助物镜焦距和损耗光束入射显微成像系统的物方倾斜角影响的并行荧光擦除图案周期公式。然后据此公式和实际光学系统中的约束条件,理论分析光学系统参数对并行荧光擦除图案周期的影响规律,计算出能减小并行荧光擦除图案周期的系统最佳光学参数。发现损耗光束入射显微成像系统的物方倾斜角越小、辅助物镜焦距越大时,系统所产生的并行荧光擦除图案周期越小,且损耗光束直径变化对并行荧光擦除图案周期的影响非常小、可以忽略。当显微物镜数值孔径为1.4、后孔径直径为8.52mm时,并行STED显微成像系统的最佳辅助物镜焦距为1000mm、最佳物方倾斜角为0.24度。最后用Zemax软件仿真研究上述最佳光学参数条件下,不同结构辅助物镜对并行荧光擦除图案周期的影响。仿真结果显示:最佳光学参数条件下使用双胶合透镜或双凸透镜作为辅助物镜产生出的并行荧光擦除图案效果最好,综合考虑各种正透镜的性价比后,我们认为双凸透镜是并行STED显微成像系统辅助物镜的最佳选择。在此基础上,本文提出一种基于光楔的新型并行荧光擦除图案产生方法,该方法可灵活调控损耗光束入射并行STED显微成像系统的物方倾斜角使其达到最佳光学参数值,以产生出比已报道方法周期更小的并行荧光擦除图案,进而实现更高的成像分辨率。
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