【摘 要】
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研究背景肺癌患者确诊时多为晚期,病情进展迅速,虽然近几年患者五年生存率有所提高,但仍急需深入研究发病机制和创新治疗药物及方案。目前肺癌治疗研究主要集中在靶向免疫治疗和新型治疗药物的研发,合适的临床前肺癌模型是这些研究成功的关键。叙利亚仓鼠常被用于研究呼吸系统疾病,其呼吸道生理结构与人体十分相似,且仓鼠自发肺部肿瘤的概率极低。有研究表明人的细胞因子在叙利亚仓鼠体内具有生物学功能,仓鼠的免疫系统与人体
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研究背景肺癌患者确诊时多为晚期,病情进展迅速,虽然近几年患者五年生存率有所提高,但仍急需深入研究发病机制和创新治疗药物及方案。目前肺癌治疗研究主要集中在靶向免疫治疗和新型治疗药物的研发,合适的临床前肺癌模型是这些研究成功的关键。叙利亚仓鼠常被用于研究呼吸系统疾病,其呼吸道生理结构与人体十分相似,且仓鼠自发肺部肿瘤的概率极低。有研究表明人的细胞因子在叙利亚仓鼠体内具有生物学功能,仓鼠的免疫系统与人体较为相似,可用于评价溶瘤病毒等靶向免疫治疗的疗效,而目前极度缺乏相关的叙利亚仓鼠动物模型和细胞模型。叙利亚仓鼠肺肿瘤模型及肺肿瘤细胞系的建立,能够为肺癌体内、体外研究提供更多的实验模型。目的本课题拟用携带有叙利亚仓鼠KRAS基因突变体KRASG12D的慢病毒通过鼻腔滴注的方式感染Tp53基因突变的叙利亚仓鼠肺部,构建叙利亚仓鼠肺肿瘤模型和肺肿瘤细胞系。通过对肿瘤模型和细胞系进行分析,确定其生物学特征,为肺癌的发生机制和肿瘤靶向免疫治疗提供新的临床前模型。方法用携带有叙利亚仓鼠KRAS基因突变体KRASG12D的慢病毒滴鼻感染Tp53基因突变的仓鼠肺部,通过对仓鼠生存状态的观察,选定合适时机进行解剖取材,对肿瘤组织进行病理学分析和原代培养,并鉴定肺肿瘤细胞系的生物学特性。1.叙利亚仓鼠肺肿瘤模型的构建1.1利用第二代慢病毒包装系统生产表达KRASG12D的慢病毒和空载体慢病毒,浓缩病毒并检测病毒的滴度。1.2将Tp53基因突变的叙利亚仓鼠分为A、B、C三个组,分别用PBS、空载体慢病毒、表达KRASG12D的慢病毒滴鼻感染叙利亚仓鼠的肺部。在仓鼠出现濒死状态时,进行解剖、取材。1.3鉴定叙利亚仓鼠肺部肿瘤,通过对肿瘤组织的HE染色、免疫组化结果来鉴定肿瘤类型。2.叙利亚仓鼠肺肿瘤细胞系的构建和鉴定2.1将肿瘤组织切割后,用胶原酶进行消化,在37℃,5%CO2的培养箱中进行培养,差速贴壁法去除成纤维细胞,将纯化的肿瘤细胞进行传代培养。2.2通过绘制肿瘤细胞生长曲线、PCR鉴定、软琼脂克隆形成实验、染色体核型分析等实验鉴定细胞系的生物学特性。2.3将建立的叙利亚仓鼠肺肿瘤细胞系接种至野生型叙利亚仓鼠的皮下,监测肿瘤细胞系的成瘤速度,并观察是否发生转移。2.4将建立的叙利亚仓鼠肺肿瘤细胞系进行全基因组重测序。结果1.叙利亚仓鼠肺肿瘤模型的构建携带有叙利亚仓鼠KRAS基因突变体KRASG12D的慢病毒可诱导Tp53基因突变的叙利亚仓鼠形成肺部肿瘤。HE染色发现肿瘤组织内存在支气管和肺泡等结构,支气管黏膜下有异常淋巴细胞的大量聚集。肿瘤组织的免疫组化显示可在支气管黏膜下的淋巴细胞群中检测到CD20阳性的B淋巴细胞,提示肺部肿瘤组织为B细胞来源的肺淋巴瘤。2.叙利亚仓鼠肺肿瘤细胞系的构建和鉴定成功建立叙利亚仓鼠肺淋巴瘤细胞系GHLC-1,GHLC-1细胞系的细胞活力较好,克隆形成能力偏弱,染色体数目异常。PCR实验结果显示,GHLC-1细胞系表达CD19、CD22、CD79a分子。GHLC-1细胞系可在野生型叙利亚仓鼠皮下成瘤,并会发生肺转移。结论1.携带有叙利亚仓鼠KRAS基因突变体KRASG12D的慢病毒可诱导Tp53基因突变的叙利亚仓鼠形成肺淋巴瘤。2.成功构建叙利亚仓鼠肺淋巴瘤细胞系GHLC-1。
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