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该文就HIV-1-GP41胞外区蛋白在大肠杆菌中难以表达的原因进行了如下探索,并通过突变过表达了gp41的胞外区:1.该实验前期工作发现HI V-gp41全长,胞外区片断均不能在大肠杆菌中有效表达,经对GP41蛋白进行蛋白质二级结构预测,发现N端融合肽及跨膜区均形成典型的穿膜螺旋结构.因而该文以HIV-1 HXB2标准株gp41基因作为研究材料用PCR方法分别构建pET表达质粒pET-Ect(GP41胞外区),pET-2/3 △ FD(N端2/3缺失融合肽片断),pET-Ect del(缺失融合肽和跨膜区片断),pET-Fusl(含N端融合肽)进行诱导表达,发现只有pET-Ect del,pET-Fus1片断能有效表达,试验结果证实了蛋白质二级结构的预测:即N端融合肽及FN1的C端的40个氨基酸是影响GP41胞外区表达的重要因素.2.在此实验结果的基础上,分别从胞外区Ect片断的N端(融合肽)进行系列缺失(EctΔ1,EctΔ2),和从C端进行缺失(EctΔ3),构建不同缺失片断表达质粒进行诱导表达,以期更精确的找出影响GP41胞外区表达的氨基酸序列.蛋白表达结果发现,N端融合肽中11个氨基酸和近跨膜的28个色氨酸富集区是影响gp41胞外区表达的关键序列.3.综合上述实验结果选择N端融合肽中的三个疏水性氨基酸和近跨膜区中四个保守的色氨酸进行突变.结果发现Ect中N端融合肽单纯的疏水氨基酸突变并不能改善Ect表达;近跨膜区保守的色氨酸突变使gp41胞外区蛋白有效表达,Western检测免疫原性良好.活菌计数则证明,色氨酸富集区和其中保守的色氨酸具有细胞毒性作用,缺失或突变保守的色氨酸后Ect片断毒性下降,活菌数上升.4.辅助以[3H]尿嘧啶释放实验,对部分片段对表达宿主细胞的通透作用进行了检测,探讨胞外区片断表达量,毒性,及穿膜作用之间的关系.