舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma, TSCC)是发病率最高的口腔鳞状细胞癌,其患病率在最近几年呈逐步上升的趋势,五年生存率仅维持在百分之五十左右,同时晚期病例的五年生存率常常低于百分之三十。目前主要的治疗方法是手术治疗为主的多学科综合序列治疗,但手术治疗常造成患者语言、进食、呼吸等功能的障碍和颜面畸形,且复发率高,容易发生淋巴结或远处器官转移。一般来说恶性肿瘤的发生以及发展是一个连续的多步骤的过程,包括不典型增生、原位癌、浸润癌、淋巴结转移癌、远处转移癌等五个阶段,舌鳞癌也应该不会例外。增殖活性上升以及细胞凋亡受到抑制是舌鳞癌非常重要的生物学特性。因为对舌鳞癌增殖凋亡特性的干预是舌鳞癌治疗的重要策略,所以对舌鳞癌增殖凋亡机制的研究显得极为重要。针对造成肿瘤细胞增殖凋亡的特性,探讨一种即能有效治疗肿瘤,又尽量保留患者面部外形、咀嚼、语言等正常生理功能的方法,是目前迫切需要解决的难题。由此在临床实际工作中,医师希望能够发现与舌鳞状细胞癌的形成以及发展有紧密关系,同时又可以客观和准确的评估舌鳞状细胞癌患者预后的生物医学靶标,为患者量身定制具体有效的个体化的治疗方案,从而增加舌鳞状细胞癌病人的生存率以及提高他们的生活质量。根据核苷酸的长度,非编码RNA通常分为两大类：短片段非编码RNA(包括shRNA、miRNA、piRNA等)和长片段非编码RNA(Long non-noding RNA,lncRNA)。近年来的关注重点大多聚焦在短片段非编码RNA上,例如microRNA以及小干扰RNA,同时也有大量关于各种动物和植物的基因组中关于microRNA的相关研究报告。虽然哺乳种类的动物的基因组能够编码众多的长链非编码RNA,但因为它不但是一组内源性,长度超过200个核苷酸,并且缺少特异的完整开放的阅读框架以及没有蛋白质编码功能的核糖核酸。所以从一开始长片段非编码RNA就被认为是核糖核酸聚合酶Ⅱ转录所产生的附属产品,不会具有相对应的生物学作用,是基因组转录的“垃圾和噪声”。但近年来的许多研究都表明示incRNA参与了一系列重要的细胞调节过程。例如长链非编码RNA参与了调节目标基因的转录、遗传印记以及细胞核内的运输等众多关键的调节控制的过程,和其它包括脱氧核糖核酸甲基化、遗传印记以及染色质的重新构建等表观遗传形式一样,与疾病的关系持续成为关注的热点。此外,在2011年度《Cancer Research》中报道,Tsai发现长链非编码RNA有助于肿瘤的早期诊断,预后的判断和可以作为分子靶向治疗的目标基因,因此具有较好的临床应用价值。最近几年一般研究认为LncRNA的功能主要有下面八种：(1)可以借助位于编码蛋白基因的上游的启动子区域发生转录,从而干扰末端相关基因的表达(如酵母里面的SER3基因)(2)能够通过利用与蛋白编码基因的转录本形成互补双链,从而干扰mRNA的剪切,并且产生不同的剪切形式(3)介导抑制RNAPⅡ转录反应中应中的各组分、甚至是DNA双螺旋结构或者通过染色质区域进行重塑和组蛋白的修饰,影响下游末端的相关基因的表达(4)借助与蛋白编码基因转录本的互补形成双链,进而内源性的小干扰RNA会在Dicer酶作用下分解产生出来,从而使得相关基因的表达被调节；(5)可以和蛋白质互相作用形成核酸蛋白结合体(6)借助和特定蛋白质结合在一起,长链非编码RNA转录本从而能够调节控制相对应蛋白质的活性(7)能够作为小分子RNA(如：Piwi-interacting RNA以及微小RNA)的前体分子,进行转录的调节控制等(8)长链非编码RNA能够通过借助与特定蛋白质的结合进一步更改这个蛋白的在细胞质中的位置定点。而且在近年来的研究表明,长链非编码RNA在肝癌、乳腺癌以及肺癌等多种肿瘤中的形成以及发展起到十分关键的调控作用。T-UCR是存在人类许多种肿瘤中表达的具备十分保守特征的那类长链非编码RNA的称谓,在以往的研究中uc.73等与人类的多种肿瘤如大肠癌、成神经细胞瘤以及乳腺癌和白血病的关系密切,影响着它们的发生发展。但它们影响肿瘤的机制仍不清楚,其中uc.338是由多聚胞嘧啶结合蛋白2(poly(rC) binding protein2, PCBP2)基因独立转录形成的转录片段,TUC338就是克隆该转录片段而来的。TUC338对肿瘤的增殖活性以及细胞凋亡发挥着十分重要调控作用。研究表明,通过RNA干扰肝癌细胞系]3epG2和Huh-7细胞中TUC338的表达,能够有效抑制肝癌细胞的增殖能力。同时研究还表明,TUC338的表达与肝癌细胞的凋亡变化和细胞周期改变存在密切的关系。转染减少了TUC338在肝癌细胞的表达,进而可以改变该肝癌细胞细胞周期的分布,使得DNA合成期的细胞数目减少。另外在舌鳞癌研究领域,有国内研究者发现长链非编码RNA MEG3在舌鳞癌中低表达,临床预后效果较差,并且通过体内实验间接升高MEG3表达从而抑制细胞增殖和改变细胞周期分布,引发了细胞的凋亡。其中有可能存在的机制是沉默了mRNAmiR-26a以后抑制脱氧核糖核酸甲基转移酶3B (DNMT3B)勺转录,从而导致MEG3发生改变。另外Fang通过研究UCA1发现,UCA1在舌鳞癌中高表达,癌细胞中UCA1高表达提示转移,但与增生不相关。这都使得我们推测长链非编码RNA可能与舌鳞癌的形成和发展存在着相当紧密的联系。高通量测序(High-throughput sequencing, HTS)的发明是基因组学研究领域一个具有标志性意义的事件。自从二十世纪70年代末第一代高通量测序技术出现之后发展迅速。在2010年Life Technologies公司的推出了新一代的测序技术Ion Torrent Personal Genomic Machine (PGM)它通过使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系,具备有简单、抗干扰、快速、灵活、费用低的优点。可以测量的序列通量是第一代方法的数千倍以上,因为每次标准的测序耗时短,很好的弥补了现今高通量测序中“无快速测序模式”的缺点。IonTorrent诞生以来人们主要用于病原微生物的检测、个体基因组以及肿瘤的检测。综上所述,本研究首先通过Ion Torrent高通量筛选检测长链非编码RNA在舌鳞状细胞癌及其对应癌旁组织表达是否存在差异。跟着检测TUC338在舌鳞癌组织中的表达情况,明确其在舌鳞癌中的表达意义。同时假设TUC338调控机制可能在舌鳞状细胞癌的增殖、凋亡中扮演着重要角色。此外我们很自然联想到TUC338在舌鳞癌增殖和凋亡中的作用机制是否与其他肿瘤存在差别?TUC338在舌鳞癌增殖和凋亡发挥实质作用的信号通路是什么?以上问题查阅国内外最新文献,均未见相关研究。同时针对TUC338的舌鳞癌基因靶向治疗也需要对TUC338真正发挥作用的通路以及靶基因进行准确定位。因此本研究拟通过构建靶向TUC338慢病毒载体,选取舌鳞癌细胞株CAL-27和SCC-9作为研究对象,并转染舌鳞癌细胞株。通过基因沉默技术从基因功能层面研究观察TUC338对舌鳞癌细胞的调控作用,并进一步明确舌鳞癌细胞功能变化与TUC338表达相互变化的相关性。根据CAL-27和SCC-9的功能变化,检测相应的下游相关因子,拟在此基础上明确TUC338调节舌鳞癌细胞的具体信号通路,为以TUC338为调控靶点进行舌鳞癌的基因治疗提供了实验依据。本研究分为三个部分：第一章舌鳞癌组织长链非编码RNA的高通量检测和分析研究目的：本研究利用Ion Torrent高通量测序技术,检测舌鳞癌组织以及对应的癌旁组织之间长链非编码RNA表达谱的差异,探讨长链非编码RNA在基因调控中可能存在的作用,为进一步研究相关长链非编码RNA在舌鳞癌发病机制中的作用打下基础。研究方法：在本实验选取对一对典型病例的新鲜舌鳞癌组织以及其对应的癌旁组织的表达谱进行了比较,分别设定了实验组(舌鳞癌组织)和对照组(对应的癌旁组织)。同时应用Ion TorrentRNA-Seq(高通量测序技术)对一典型例舌鳞癌组织以及其对应的癌旁组织的表达谱进行了比较,把测出的序列和Ensemble6.8数据库的LncRNA数据进行比对,用Bowtie2的方法挑出lncRNA的Read,然后用Tophat和Cufflinks方法计算个LncRNA的RPKM值。截取癌症比癌旁RRPKM大于10和小于0.1的10+候选LncRNA作为候选目标基因。研究结果：基因表达谱Micro Arry的研究和发现：10346个基因上调表达,14683个基因下调(安捷伦芯片,表达差异倍数阈值为2)。把测出的序列和Ensemble6.8数据库的LncRNA数据进行比对,用Bowtie2的方法挑出LncRNA的Read,然后用Cufflinks方法计算个LncRNA的RPKM值。截取癌症比癌旁IRPKM大于10和小于0.1的10+候选LncRNA进行作为候选目标基因。其中上调表达的有28个,下调表达的有24个。研究结论：1:Ion Torren高通量测序技术,具有低成本、高通量和高灵敏度的特点,是筛选舌鳞癌中长链非编码RNA的一种有效手段。2：舌鳞癌组织和癌旁组织中存在差异表达的长链非编码RNA分子,因此LncRNA表达谱有可能成为舌鳞癌基因治疗的重要潜在靶点。第二章舌鳞癌组织和舌鳞癌细胞系中长链非编码TUC338的检测及SH-TUC338载体的构建研究目的：本实验决定选取TUC338作为主要功能研究的LncRNA和治疗靶点。同时为了排除假阳性验证筛选的结果。我们扩大了样品量,利用QRT-PCR技术对舌癌组织及其对应癌旁组织(15例)进行测定,进一步确定了TUC338在舌癌组织中的表达和临床意义,为后续研究打下基础。同时为了应用RNA干扰技术沉默舌鳞癌细胞株中TUC338基因的表达,构建TUC338shRNA质粒。研究方法：选取2013年5月年到2014年12月,广东省口腔医院、中山大学附属第五医院和广州市第一人民医院口腔颌面外科确诊的15例舌鳞状细胞癌患者的新鲜舌鳞癌组织以及其对应的癌旁组织(切缘2.0cm以外)(术前均未行任何抗肿瘤治疗),采用实时定量PCR技术(QRT-PCR,quantitative real-time polymerase chain reaction)测定两者的TUC338mRNA比值。按美国著名RNA产品公司Ambion提供的在线siRNA设计原则,首先选取两段siRNA转染进入舌鳞癌细胞株CAL-27中,检测细胞株中TUC338mRNA的表达量选取效率更高的干扰片段。最后合成TUC338shRNA慢病毒载体。研究结果：发现TUC338在15例舌鳞癌新鲜组织中表达均有上升,相对于癌旁组织有显著升高(t=5.132,P<0.001)。另外Si片段均可以显著降低舌鳞癌细胞株CAL-27中TUC338mRNA的表达,其中Si2效率更为显著(t=-33.368,P<0.001)。选取Si2化学合成对应的片段,退火后通过BamHI和EcoRI酶切位点连接到慢病毒载体中,合成对应的TUC338shRNA慢病毒载体和阴性对照载体。最后测序结果证明载体构建成功,显示目的片断正确插入载体中表达载体中,并且经过QRT-PCR验证。采用SPSS 20.0统计软件包进行分析处理,均采用单一样本t检验。P<0.05视为有统计学意义。研究结论：1：舌鳞癌组织中的TUC338mRNA的表达显著高于相对应的舌鳞癌癌旁组织,长链非编码RNATUC338可以作为为舌鳞癌患者治疗的参考目标基因之一。2：成功构建了一个有效的针对长链非编码RNATUC338基因的shRNA干扰载体,并且可以有效地抑制长链非编码RNATUC338在舌鳞癌细胞株中的表达。为以后的体内以及体外功能实验打下良好的基础。第三章沉默长链非编码RNATUC338对舌鳞癌细胞株SCC-9和CAL-27功能的影响以及相关信号通路的研究研究目的：通过RNAi技术将TUC338-shRNA干扰片段转染舌鳞癌细胞株CAL-27和SCC-9中。通过抑制TUC338的表达,观察舌鳞癌细胞侵袭、迁移、增殖、凋亡和细胞周期的变化以及和TUC338表达的相关性。明确长链非编码RNATUC338对舌鳞癌细胞侵袭、迁移、增殖、凋亡以及周期分布等功能变化的影响。并在此基础上,检测相关下游因子STAT、p-STAT1、AKT、p-AKT和caspase-3的表达变化,探讨LncRNATUC338表达变化对CAL-27和SCC-9细胞增殖、凋亡影响的机制。研究方法：舌鳞癌CAL-27和SCC-9细胞在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下,在含10%的DMEM培养液中培养。TUC338-shRNA干扰片段由广州塞哲生物科技有限公司完成的设计和合成,构建沉默TUC338基因的细胞模型,同时设立阴性对照组和空白载体对照组。采用QRT-PCR检测TUC338mRNA的表达,p-actin作为内参。MTT实验检测TUC338-shRNA干扰片段转染下调TUC338表达对舌鳞癌细胞增殖的影响。流式细胞仪检测TUC338-shRNA干扰片段转染抑制TUC338表达对舌鳞癌细胞凋亡和细胞周期分布的改变。Transwell实验和迁移实验检测TUC338-shRNA干扰片段转染抑制TUC338表达对CAL-27和SCC-9细胞体外侵袭迁移能力的影响。采用Western blot检测STAT1、p-STAT1、AKT、 p-AKT和Caspase-3的表达,以GAPDH作为内参。采用SPSS 20.0统计软件包进行分析处理。增殖、侵袭、迁移抑制率采用独立样本t检验；凋亡率、细胞周期采用多样本方差分析。取α=0.05水平,P<0.05视为有统计学意义。研究结果：MTT检测TUC338-shRNA干扰片段转染下调TUC338表达72小时后,CAL-27中对照组和实验组的增殖能力抑制率分别是3.15±12.75%和58.26±13.87%(t=-6.541,P<0.001); SCC-9中对照组和实验组的增殖能力抑制率分别是6.05±12.58%和61.94±12.06%(t=-7.171,P<0.001)。结果显示：TUC338基因表达下调导致CAL-27和SCC-9细胞增殖受到显著抑制。TUC338基因表达下调后CAL-27中对照组和实验组的侵袭抑制率分别是-161.16±75.10%和-122.16±57.80%(t=--0.920,P=0.384); SCC-9中对照组和实验组的侵袭抑制率分别是25.79±23.62%和-1.52±4.79%(t=-2.530,P=0.060)。CAL-27中对照组和实验组的迁移抑制率分别是55.97±11.96%和46.56±3.10%(t=1.703,P=0.127); SCC-9中对照组和实验组的迁移抑制率分别是50.24±9.56%和53.83±8.61%(t=-0.624,P=0.550)。结果显示：TUC338表达下调,CAL-27和SCC-9细胞体外侵袭和迁移能力无显著变化。TUC338-shRNA干扰片段转染CAL-27和SCC-9细胞后,在CAL-27细胞空白组、阴性对照组和实验组的早期凋亡率分别是：5.79±0.15%,、6.61±0.24%、9.20±0.03%,实验组较对照组凋亡显著增加(F=6032.181,P<0.001)；在SCC-9细胞株中9.43±0.89%、10.22±0.55%、13.41±0.38%,实验组较对照组凋亡显著增加(F=32.671,P=0.001),结果显示舌鳞癌细胞的凋亡率显著增加。流式细胞仪的检测结果显示：SCC-9的G2/M期细胞发生滞留,实验组较对照组细胞比例显著增加(F=32.987,P<0.001)；CAL-27中S期细胞分布,实验组较对照组细胞比例未发生显著变化(F=2.063,P=0.185),SCC-9中的S期细实验组较对照组细胞比例同样未发生显著变化(F=7.453,P=0.175)。下游相关因子检测中,Western blot结果显示TUC338-shRNA干扰片段转染CAL-27和SCC-9细胞后对STAT1、p-STAT1、AKT和p-AKT的蛋白表达受到抑制,同时Caspase-3蛋白的表达增加。研究结论：长链非编码RNA TUC338基因表达下调能够显著抑制CAL-27和SCC-9的细胞增殖能力,同时可以增加细胞的凋亡。令到下游相关因子发生改变,但对细胞的侵袭迁移无影响。全文结论：1:Ion Torren高通量测序技术是筛选舌鳞癌中LncRNA表达差异的一种有效和理想的方法。2：利用QRT-PCR技术明确了TUC338在舌鳞癌中的表达差异,并且通过分子生物学的技术验证了TUC338基因表达的变化与舌鳞癌细胞功能改变的关系。对舌鳞癌中TUC338调控下游基因进行研究,更加全面认识了TUC338对舌鳞癌可能的作用机制。为舌鳞癌的生物治疗提供新的切入途径。3：长链非编码RNA TUC338可能是舌鳞癌新的基因治疗靶点。