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大肠埃希菌的多药耐药性已成为目前观察到的令人不安的问题,并且也被认为是抗生素耐药基因传播的一个重要因素。随着抗菌药物在临床上的普遍应用,碳青霉烯类耐药大肠埃希菌的检出率呈现逐年增长的趋势。研究表明碳青霉烯类耐药的主要机制是碳青霉烯酶的产生,其中肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）是耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）中最普遍的,但其在大肠埃希菌中检出率普遍较低。噬菌体排斥系统BREX（Bacteriophage Exclusion）作为新进被发现的细菌免疫系统,存在于10%的细菌、古细菌基因组中。目前BREX系统被分为六种亚型,其中大肠埃希菌中为I型BREX系统,它是由六个基因组成的基因簇构成,编码RNA结合抗终止蛋白（brx A）、功能未知蛋白（brx B）、ATP结合蛋白（brx C）、甲基转移酶（pgl X）、碱性磷酸酶（pgl Z）、Lon样蛋白酶（brx L）。研究表明BREX系统可赋予细菌对多种噬菌体的全部或部分抗性,对于质粒BREX系统也具有一定的靶向作用。目前BREX系统的防御机制研究尚未明确,研究发现其与限制修饰（RM）系统作用相似,通过甲基化以区分自身与外源性DNA,但不同之处在于BREX系统甲基化非回文基序,且BREX系统并非通过切割或降解噬菌体DNA发挥其防御作用。在携带RM系统的细菌中,甲基化酶的缺失将不利于细菌生长,但BREX系统中pgl X的缺失却不会导致这一现象。目前尚未有研究表明BREX系统在大肠埃希菌中的流行情况以及BREX系统与抗菌药物敏感性之间是否存在关联。虽然BREX系统对质粒具有一定的靶向性,但BREX系统是否起到类似CRISPR-Cas系统一样的作用阻遏耐药质粒的传播,保持细菌对抗菌药物的敏感性都尚未进行研究。这些细菌防御系统对于外源性遗传物质的专有靶向性研究以及日后的抗菌预防药物和疗法都有着巨大的影响。综上所述本研究将从以下两个部分展开研究:BREX系统在大肠埃希菌中的流行情况及其与抗菌药物敏感性的关系;BREX系统是否会阻遏大肠埃希菌中KPC耐药质粒的获得。第一部分:大肠埃希菌中BREX系统的流行情况及其与抗菌药物敏感性的关系目的:通过流行病学研究分析在大肠埃希菌中携带BREX系统菌株的分布情况,该类菌株中常见耐药基因、菌株ST型分布关系,并进一步探索其与抗菌药物敏感性之间的关系。方法:收集复旦大学附属华山医院2017年1月至2017年12月临床分离的非重复的大肠埃希菌,PCR初步筛选携带BREX系统中pgl Z基因的菌株,将这些菌株送全基因组二代测序明确具有完整功能的BREX系统菌株,并进一步分析这些菌株ST分型、耐药基因携带情况。采用琼脂稀释法和微量肉汤稀释法检测所有424株菌对17种抗菌药物的敏感性。为避免菌株地域差异对结果造成的影响,我们对NCBI完成全基因组三代测序的大肠埃希菌共计1039株进行以下分析:BREX系统在大肠埃希菌中的分布情况以及BREX系统所在菌株的ST分型以及耐药基因分布情况。结果:收集2017年临床分离的非重复大肠埃希菌共424株,其中PCR初步筛选pgl Z阳性菌株23株,送二代测序结果回执显示23株菌均具有完整的BREX系统,BREX系统检出率为5.4%（23/424）。耐药基因分析显示BREX系统阳性菌株中,碳青霉烯类耐药基因均未检出。在超广谱β内酰胺酶（ESBLs）检测中发现,有12株携带ESBLs耐药基因,且均为blaCTX-M。ST分型显示ST131是其优势克隆型别占56.5%（13/23）。药物敏感性试验结果显示,临床分离的大肠埃希菌中BREX系统与抗菌药物敏感性有着一定的联系,且与多重耐药之间呈负相关,携带BREX系统的大肠埃希菌对常见抗菌药物耐药率均低于缺乏BREX系统的大肠埃希菌。本研究重点关注碳青霉烯类抗菌药物,在缺乏BREX系统的401株临床大肠埃希菌中,有80株（20%）对碳青霉烯类耐药;而携带BREX系统的23株大肠埃希菌对碳青霉烯类药物敏感。在NCBI完成全基因组三代测序的大肠埃希菌中,BREX系统检出率为5.6%（59/1039）。耐药基因分析显示BREX系统阳性菌株中碳青霉烯类耐药基因KPC检出率为0,NDM检出率1.6%（1/59）,有13株携带ESBLs耐药基因。ST分型显示主要ST分型为ST16占23.7%（14/59）、ST131占13.5%（8/59）。结论:BREX系统在大肠埃希菌中的检出率为5%左右,ST131型为携带BREX系统的大肠埃希菌的优势克隆型,常见碳青霉烯类耐药基因KPC、NDM在携带BREX系统的菌株中检出率极低。BREX系统的分布与抗菌药物敏感性存在关联。第二部分:大肠埃希菌中BREX系统阻遏blaKPC质粒的传播机制研究目的:文献研究显示blaKPC在大肠埃希菌中检出率低,结合前期研究发现携带BREX系统的菌株中blaKPC均未检出,以及携带BREX系统的菌株与碳青霉烯类抗菌药物敏感性之间存在负相关关系,本部分拟对BREX系统对于blaKPC质粒是否起到阻遏作用展开研究。方法:PCR筛选2017年临床收集的大肠埃希菌中blaKPC阳性菌株,送全基因组三代测序,进一步行blaKPC质粒分型,以及相应菌株ST分型分析。并对携带blaKPC的菌株进行质粒接合实验,将其接合进入大肠埃希菌J53为后续接合实验制备只带有blaKPC质粒的接合实验供体菌。对上述BREX系统阳性菌株进行λRed同源重组敲除BREX系统,原始株及敲除株与带有blaKPC质粒的J53进行质粒接合实验,通过原始株、敲除株与blaKPC质粒接合效率对比,分析BREX系统对于blaKPC质粒是否具有阻遏作用。为避免存在其他因素对实验结果存在干扰,将大肠埃希菌中完整的BREX系统克隆至载体p HSG398,将其命名为p BREXAL并化转进入大肠埃希菌DH5α,同时将空载p HSG398化转入大肠埃希菌DH5α作为对照,进一步通过质粒接合实验对比接合效率,来判断BREX系统对blaKPC质粒的阻遏作用。为避免菌株地域差异对结果造成的影响,我们对NCBI完成全基因组三代测序的大肠埃希菌共计1039株也进行以下分析:菌株ST分型;blaKPC在大肠埃希菌中的分布,耐药质粒分型以及相应菌株ST分型。结果:2017年临床分离的424株大肠埃希菌中blaKPC的检出率为1.2%（5/424）。blaKPC均位于质粒上,质粒分型结果显示为Inc C（2/5）,Inc P1（1/5）,Inc FIA（1/5）,Inc FIA/FIB/P1（1/5）。ST分型结果显示ST131型占40%（2/5）,ST7358型占40%（2/5）,ST648型占20%（1/5）。并且blaKPC均分布在BREX系统阴性菌株中。在NCBI完成全基因组三代测序的大肠埃希菌中,blaKPC检出率为3%（31/1039）,除了3358这株菌在染色体中携带blaKPC外,其他30个分离株中blaKPC均由质粒携带。Inc N为最常见的质粒分型,30株菌中有12株为该类质粒类型。31株携带blaKPC的大肠埃希菌被分为15个不同的ST型别,其中ST131（14/31,45.16%）为其优势克隆。并且blaKPC均分布在BREX系统阴性菌株中。与携带BREX系统的原始菌株3756相比,敲除株3756-ΔBREX中blaKPC质粒接合效率明显增高（P＜0.0001）。带有空载体的DH5α-p HSG398与化转带有完整BREX系统的DH5α-p BREXAL对于blaKPC质粒接合效率相比明显增高（P＜0.0001）。结论:在大肠埃希菌中blaKPC检出率低,与KPC-CRKP相比其优势克隆与质粒分型存在差异。BREX系统在大肠埃希菌中可以起到阻遏blaKPC质粒传播作用。