[研究目的]1.探讨FHIT基因在人肝癌组织和癌旁组织中的表达差异,分析FHIT基因的表达差异与肝癌临床病理因素及术后生存期的关系,有望揭示FHIT基因表达差异在肝癌的发生、发展以及手术预后中的作用及其临床意义,为后续进一步研究肝癌发生的分子机制奠定基础。2.通过检测FHIT基因含量不一致的三个肝癌细胞株HepG2、Hep3B和Huh7的启动子甲基化状态,进一步研究FHIT基因启动子甲基化水平与其蛋白表达水平的关系,从而阐述FHIT基因启动子甲基化与肝癌的发生、发展相关的部分机制。3.通过体外成功构建慢病毒重组载体pLVX-IRES-FHIT,探讨过表达FHIT基因对FHIT基因含量不一致的人肝癌细胞株HepG2、Hep3B和Huh7的增殖、凋亡和细胞侵袭以及细胞周期的影响,进一步研究FHIT基因通过β-catenin/TCF-4信号通路抑制cyclinD1的转录活性。4.体外构建信号通路关键基因cyclinD1的荧光素酶报告质粒(promoter cyclinD1 luciferase reporter plasmid,p-1745-CD1-LUC)转染HepG2细胞,利用免疫共沉淀实验共转染pcDNA3.0/pHA-FHIT/β-catenin质粒,观察cyclinD1转录活性和蛋白表达水平的变化,探讨FHIT基因通过经典的Wnt-β-catenin/TCF-4信号通路调节肝癌细胞生长的分子机制。5.本课题通过临床相关研究及体外细胞实验研究,全面系统地叙述FHIT基因调控人肝癌细胞增殖凋亡、细胞周期以及细胞侵袭的效应和通过经典的Wnt-β-catenin/TCF-4信号通路调节肝癌细胞生长的分子机制,将对肝癌新的标志物筛选及术后生存期的预后和评估,为肝癌的早期诊断、分子靶向治疗提供理论和实验的依据。[研究方法]1.临床研究：收集90例临床资料和随访记录完整的原发性肝癌病人的手术标本,以相应的癌旁组织为对照,以免疫组化染色技术制作组织芯片,观测上述标本中FHIT基因表达差异,分析FHIT基因与肝癌临床病理因素和术后生存期的关系及意义。2.培养人肝癌细胞株HepG2、Hep3B和Huh7,分别收集细胞总蛋白,Western blot检测三个细胞系中FHIT蛋白表达水平。培养人肝癌细胞株HepG2、Hep3B和Huh7,分别收集细胞DNA,用亚硫酸氢盐处理DNA,利用甲基化特异性PCR(Methylation-special PCR, MSP)检测FHIT启动子区的甲基化表达水平。用5-Azadc处理HepG2.Hep3B和Huh7细胞,分别收集细胞总蛋白,Western blot检测三个细胞系中FHIT蛋白表达水平。3.体外成功构建pLVX-IRES-FHIT慢病毒重组载体转染FHIT基因含量不一致的肝癌细胞株HepG2、Hep3B和Huh7,观测三系肝癌细胞株增殖凋亡、细胞侵袭性和细胞周期的变化。提取肝癌细胞Huh7总RNA,采用RT-PCR扩增FHIT全序列,通过T-FHIT载体和病毒载体pLVX-IRES-mCherry进行双酶切,通过DNA测序鉴定,成功构建pLVX-IRES-FHIT慢病毒重组真核表达载体。阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导转染肝癌细胞株HepG2、 Hep3B和Huh7,同时以转染空载体为空白对照。以RT-PCR. Westernblot检测转染后三系肝癌细胞株转录和翻译水平的变化。以MTT法、FCM法、Annexin V/PI双染色法、细胞周期检测技术和Transwell侵袭实验分析过表达的FHIT基因对三系肝癌细胞的增殖活性、凋亡、细胞侵袭性和细胞周期的影响机制极其生物学效应与时间梯度的关系。4.分子克隆获得FHIT基因序列,构建pHA-FHIT重组融合基因表达载体。阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导pHA-FHIT表达载体和pcDNA3.0空载体分别转染入人原发性肝癌细胞株HepG2中,分为FHIT-HA组、pcDNA3.0组,以pcDNA3.0空载体组为阴性对照。转染后培养48小时,收集细胞,提取细胞总蛋白,利用Western blot检测FHIT蛋白表达水平,同时利用克隆形成实验检测HepG2细胞的生长情况。阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导pHA-FHIT表达载体和pcDNA3.0空载体分别转染入人原发性肝癌细胞株HepG2中,分为FHIT-HA组、pcDNA3.0组,以pcDNA3.0空载体组为阴性对照。转染后培养48小时,收集细胞,提取细胞总蛋白,利用Western blot检测cyclinD1蛋白表达水平。构建cyclinD1的荧光素酶报告质粒p-1745-CD1-LUC质粒,与pCMV-β-galactosidase reporter融合质粒共转染HepG2中,利用免疫共沉淀实验共转染pcDNA3.0/pHA-FHIT/β-连环蛋白(p-catenin)质粒,检测cyclinD1荧光素酶活性。[研究结果]1.临床研究结果(1) FHIT基因在本实验组的人肝癌手术标本中的低表达是高概率事件(67／90；74.4%),同时癌旁组织的FHIT基因表达显著高于肝癌细胞(P<0.05)；(2) FHIT基因表达水平高低与肝癌细胞分化程度正相关(P<0.05,相关系数0.589),并与淋巴结转移有正相关性(P<0.05,相关系数0.326);(3)肝癌手术病人的生存期与FHIT基因蛋白的低表达、肝癌细胞分化、肝癌的病理分级、TNM分期和肿瘤大小密切相关,统计学有差异(P<0.05),但与性别、年龄、有无包膜、AFP大小、有无门静脉癌栓、淋巴结转移和合并肝硬化无明显相关性(P>0.05);2.三系肝癌细胞中FHIT基因启动子甲基化的研究结果(1) Westernblot结果显示,FHIT在人肝癌细胞株HepG2、Hep3B低表达,而在Huh7中表达水平相对较高；(2) 甲基化特异性聚合酶链反应(MSP法)结果显示,FHIT的启动子区在人肝癌细胞株HepG2和Hep3B中部分发生了甲基化；(3)用5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Azadc)处理HepG2、Hep3B和Huh7细胞后FHIT蛋白表达水平在HepG2、Hep3B细胞中有所升高；(4)三系肝癌细胞中FHIT基因启动子甲基化对HepG2细胞增殖最为明显；3.体外重组病毒载体pLVX-IRES-FHIT转染FHIT含量不一致的肝癌细胞株HepG2、Hep3B和Huh7的实验结果(1) FHIT基因真核载体的构建：通过T-FHIT载体和病毒载体pLVX-IRES-mCherry进行双酶切并经过DNA测序证明所获得FHIT的基因扩增序列正确；(2) pLVX-IRES-FHIT重组病毒质粒对三系肝癌细胞增殖凋亡的影响；MTT法检测显示三系肝癌细胞株的pLVX-IRES-FHIT组细胞增殖活性明显降低,且随时间推移细胞增殖抑制效果更为显著,在48小时达到高峰,此后到72小时进入平台期,对照组细胞增殖抑制不明显(P<0.05)。AnnexinV/PI双染色法检测发现pLVX-IRES-FHIT组三系肝癌细胞48h凋亡率较对照组无显著性差异(P>0.05)。三系肝癌细胞中对pLVX-IRES-FHIT组转染致FHIT基因过表达抑制增殖活性大小的顺序依次是HepG2>Hep3B>Huh7;(3) pLVX-IRES-FHIT重组慢病毒质粒对三系肝癌细胞侵袭性的影响；经过Transwell侵袭实验表明对FHIT基因过表达对三系肝癌细胞的pLVX-IRES-FHIT组侵袭性均有明显的抑制作用(P<0.05),而对照组未见明显差异(P>0.05)。三系肝癌细胞的侵袭性顺序依次为HepG2>Hep3B>Huh7,提示FHIT基因在肝癌细胞中的表达水平的差异与其细胞的分化程度有相关性。(4) pLVX-IRES-FHIT重组病毒质粒对三系肝癌细胞周期的影响细胞周期检测发现pLVX-IRES-FHIT组G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,增殖指数减低,在HepG2细胞中与对照组间有显著性差异(P<0.05),在HepB和Huh7细胞中与对照组间无显著性差异(P>0.05)。FHIT基因的过表达对三系肝癌细胞的细胞周期影响为细胞周期停滞于S期,且G0／G1期细胞增多的顺序依次是HepG2<Hep3B<Huh7。4. FHIT基因对Wnt-p-catenin/TCF4信号通路关键基因cyclinDl的影响结果；通过RT-PCR, Westernblot及信号通路关键基因cyclinD1的荧光素酶报告质粒p-1745-CD1-LUC免疫荧光染色实验和免疫共沉淀实验共转染pcDNA3.0/pHA-FHIT/β-连环蛋白(β-catenin)质粒实验显示特异性上调FHIT基因的表达可显著抑制HepG2肝癌细胞中cyclinD1的转录活性(与对照组比较P<0.05),同时可减少cyclinD1蛋白表达水平。[研究结论]1. FHIT基因是一种抑癌基因,其在肝癌细胞中的表达水平差异与肝癌细胞的分化程度、淋巴结转移密切正相关,FHIT基因参与了肝癌的发生发展过程,并由此与肝癌手术后生存期的长短正相关。FHIT基因在肝癌细胞中的低表达提示肿瘤恶性程度增加,免疫组化检测FHIT基因有助于肝癌的恶性程度判断和术后生存期预后的合理评估。2. FHIT在人肝癌细胞株HepG2、Hep3B中部分发生了甲基化,尤以HepG2为明显并且导致FHIT基因在HepG2肝癌细胞中低表达甚至缺失,从而促进了HepG2肝癌细胞的增殖。3.体外成功构建了pLVX-IRES-FHIT慢病毒重组质粒,过表达的FHIT基因可有效地抑制三系肝癌细胞株HepG2. Hep3B和Huh7的增殖活性,抑制三系肝癌细胞HepG2、Hep3B和Huh7的侵袭性,同时使HepG2、Hep3B、Huh7三系肝癌细胞的细胞周期阻滞于S期,且G0/G1期细胞数增多。4.在HepG2细胞中,过表达FHIT可抑制HepG2细胞增殖和cyclinD1的转录活性,并且减少cyclinD1蛋白表达水平。5. FHIT基因可能通过经典的Wnt-β-catenin/TCF-4信号通路抑制cyclin D1的转录活性。