目的:　　FGF21作为一种内分泌激素具有潜在治疗代谢性疾病的作用，例如2型糖尿病和肥胖。FGF21作为一种治疗药物由于其低稳定性，易于聚合的特性以及易受体内蛋白水解等原因而受到限制。通过定点诱变技术引入半胱氨酸残基得到重组人FGF21突变体，并开发了一种固相镍亲和聚乙二醇化战略。由此设计得到:固定化的蛋白的表面暴露半胱氨酸残基被用作一个平台，有效地和选择性地与PEG-马来酰亚胺结合。这种聚乙二醇化的FGF21结合物保留了其生物学功能，并且表现出半衰期增加并超过211.3分钟。通过FGF21作为原型，我们提供了一个“广义的”固相的方法有效地增加蛋白质制剂的血清半衰期。　　方法:　　（一）表达和纯化Sumo-FGF21突变体　　我们将重组人FGF21进行点突变，构建3个突变体。利用QuikChange位点定向诱变试剂盒将3个突变体质粒诱导入表达载体。接着通过PCR融合技术，扩增的PCR产物（包括突变FGF21基因与SUMO）用NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切，再将酶切得到的片段与pET3c载体酶切得到的相应片段进行连接，得到pET3c-SUMO-FGF21融合质粒，再将这个融合质粒转染入BL21(DE3)感受态细胞，再进行培养表达得到所需要的蛋白。　　收集的菌体经过离心收集和破碎处理。先经过pharose FF柱纯化，再用Ni-NTA树脂进一步纯化。最终所需的SOMO-FGF21突变蛋白进一步通过SDS-PAGE电泳和WB技术验证，并通过BCA测得蛋白浓度。　　（二）FGF21的固相PEG修饰以及纯化　　三个步骤:(1)将SUMO-FGF21溶解于HEPES缓冲液中，加入并结合到Ni-NTA亲和层析柱中。(2)在4℃条件下，将mPEG-MAL的溶液以0.01 mL/分钟流速在柱中循环，确保其共价结合到FGF21G71C突变体第71位的半胱氨酸上。最后，用平衡缓冲液洗脱未反应的mPEG-MAL。(3)用添加了咪唑的HEPES缓冲液洗脱反应后的复合物。收集洗脱液，并通过电泳确定反应混合物。最后进行脱盐浓缩处理，为了确定定点PEG特异性修饰的最佳条件，我们研究了不同的PEG/蛋白反应摩尔比与反应时间的变化对结果的影响。对稀释液进行Sumo酶切处理，接着将复合物加载到Q-Sepharose Fast Flow柱上进行剃度洗脱，收集各洗脱峰对应的洗脱液，用电泳进行分析。最后将得到的纯化蛋白进行除盐浓缩，再用纯化水稀释后在4℃保存。　　（三）脂肪细胞分化及糖吸收实验　　将3T3-L1前脂肪肝细胞以25×103铺板到24孔板中，并在铺板两天后进行诱导，更换诱导液Ⅰ两天后，跟换成诱导液Ⅱ再培养2天。在这之后继续用正常的高糖培养基培养9-20天（每隔一天换液）。在7天后就能观察到脂滴的积累＞95％的细胞数，分化7-10天的细胞用于更一步的实验。葡萄糖吸收实验时，先将分化后的细胞饥饿处理，再用FGF21WT，FGF21突变体(FGF21 A59C，FGF21G71C和FGF21A59C，G71C)，以及PEG修饰的FGF21突变体(PEG-FGF21G71C)作用24h，接着用KRP缓冲液洗两次，再用葡萄糖试剂盒进行糖吸收检测。　　（四）质谱和圆二色光谱分析　　质谱的分析是通过使用具有氮激光的Applied Biosystems VoyagerSystem DE PRO MALDI-TOF质谱仪。FGF21WT，FGF21G71C和固相修饰的PEG-FGF21(PEG-FGF21G71C)的二级结构是通过使用圆形二色光(CD)分光偏正器获得。质谱的检测进行三次平行对照实验，CD光谱仪先用缓冲液进行校准。　　（五）固相修饰的PEG-FGF21 G71C的生物稳定性和药代动力学评价为了确定在生理相关的温度条件下FGF21的定点突变体和PEG固相修饰后的生物稳定性，我们将FGF21WT，FGF21 G71C和PEG-FGF21 G71C相同的浓度在37℃条件下在小鼠血清中孵育相同的时间，然后再将样品进行葡萄糖吸收分析和以及通过人FGF21免疫测定ELISA进行定量。更进一步评价蛋白的热稳定性，我们将之前所述的蛋白加入到PBS缓冲液中在37℃条件下孵育不同的时间点，再通过葡萄糖吸收实验测定不同时间点蛋白的活性。　　非PEG化和PEG化蛋白的体内半衰期是通过单次静脉内(Ⅳ)注射FGF21WT， FGF21A59C,FGF21G71C, FGF21A59C,G71C和PEG-FGF21 G71C到成年SD大鼠中而测得，通过人FGF21免疫ELISA试剂盒测得大鼠血中蛋白的动态变化。通过药物和统计软件来确定药代动力学参数。通过t1/2=0.693/Ke公式计算得到血浆半衰期。并且各组织中蛋白的含量也通过人FGF21免疫ELISA试剂盒测得。　　（六） PEG-FGF21G71C在OB/OB小鼠中的功能性评价　　分别将成年(11-12 Weeks)肥胖Lepob/obC57BL/6(OB/OB)小鼠随机分为4组，每组6只，前三组分别用FGF21WT，FGF21G71C，和PEG-FGF21 G71C处治疗，最后一组用0.9％生理盐水作为肥胖对照组。6只正常对照C57BL/6小鼠(8-12 Weeks)用0.9％生理盐水处理作为正常对照组。我们连续7天对动物每日进行一次皮下给药，用于评价其慢性治疗作用。治疗开始后，我们对血糖，体重和食物消耗量进行了监测。在规定时间进行尾静脉取血，并检测血糖，甘油三酯的变化水平，比较FGF21和突变体之间的作用强弱以及PEG化的FGF21突变体是否具有长效抗糖尿病作用。之后，取得各组小鼠肝脏，再进行HE染色和荧光免疫组化分析。　　（七）WB分析　　将分化好的3T3-L1细胞饥饿处理，再加入FGF21WT，FGF21G71C和PEG-FGF21 G71C刺激15分钟，再裂解收集样品。通过检测磷酸化的AKT指标来比较胰岛素信号通路。另外，对给药(FGF21WT，FGF21G71C，orPEG-FGF21G71C)7天后的各组小鼠的肝脏组织也进行裂解，提取蛋白，通过检测磷酸化的AKT指标来比较胰岛素信号通路。通过与对照组对比，比较各给药药组作用强弱。　　结果:　　（一）得到突变体纯蛋白及活性结果　　三种FGF21变种（FGF21A59C，FGF21G71C和FGF21A59C, G71C）成功表达并纯化。通过融合SUMO与人FGF21，显著增强人FGF21在大肠杆菌中的可溶性表达水平。因此，我们设计的FGF21融合蛋白能够进行大规模表达和纯化。之后我们通过分化的3T3-L1细胞进行糖吸收实验，验证各突变体蛋白的活性。在体外活性中，FGF21G71C突变体比其它两种突变体（FGF21 A59C和FGF21 A59C, G71C）活性更强，并且与FGF21 WT相当。我们的体内研究表明，FGF21G71C比FGF21WT和另外两个变体(FGF21 A59C和FGF21 A59C, G71C)更稳定。因此，我们所选择的FGF21G71C突变体用于之后的实验。　　（二）突变体的固相PEG修饰和纯化结果　　结果显示，在4℃反应12小时，摩尔比为12/1时得到产率最优的单PEG修饰产物。通过SDS-PAGE电泳和扫描光密度分析结果得到，在最佳条件下，48.9％的SUMO-FGF21G71C成功的被PEG化。接着将修饰好的PEG-SUMO-FGF21G71C进行稀释并通过SUMO蛋白酶切割。最终通过Q柱进行纯化，成功得到较纯的PEG-FGF21G71C蛋白。通过MALDI-TOF质谱(MALDI-TOF-MS)分析，确保FGF21 G71C是否为单PEG修饰。我们的数据结果表明，PEG化的FGF21G71C具有的分子量为39.3 kDa，这表明，单个20kDa的PEG分子被缀合到非PEG化的FGF21G71C上。　　（三）聚乙二醇化的FGF21 G71C的结构和生化活性结果圆二色谱结果表明，突变体与野生型的FGF21的二级结构只存在细微的差别，这说明定点突变及固相PEG修饰并不改变野生型FGF21的结构。此外，葡萄糖摄取实验结果表明，FGF21G71C和聚乙二醇化FGF21G71C的生物活性均与FGF21WT完全一致。细胞通路的激活的分析也表明，FGF21突变体也能激活FGF21信号传导通路。　　（四）固相修饰的PEG-FGF21G71C生物稳定性及药代动力学结果FGF21WT，FGF21G71C和PEGFGF21G71C的生物稳定性比较是模拟体内生理环境，通过在37℃，在小鼠血清中孵育不同的时间点来比较。赋予过的每个时间点的蛋白都经过糖吸收实验，结果表明在孵育了120 h后，FGF21 WT和FGF21G71C保留原始细胞34.3％和45.1％的生物活性，而PEG化的FGF21 G71C保留了60.6％的活性。　　ELISA数据表明，PEG-FGF21G71C比FGF21G71C和FGF21 WT降解的速度慢，与活性结果一致。为了更具体的测定蛋白的热稳定性，我们将FGF21 WT，FGF21G71C和PEG-FGF21G71C在37℃PBS中孵育不同时间点。结果与血清中所得的结果一致。所有的这些结果表明，定点突变和PEG修饰都能生物稳定性和热稳定性增加，PEG修饰相比较于FGF21G71C更显著。通过人免疫FGF21ELISA试剂盒测定SD大鼠单剂量给药后体内半衰期，结果表明野生型FGF21的半衰期为23.7分钟，突变体FGF21G71C的半衰期为59.8分钟，而固相修饰的PEG-FGF21G71C的半衰期为211.3分钟，并且PEG化的突变体更能在主要器官中积累，例如肝脏，胰腺，和皮下脂肪等。　　（五）PEG-FGF21G71C在ob/ob小鼠中抗糖尿病作用结果　　通过每日皮下注射相同剂量的FGF21 WT，FGF21 G71C和PEG-FGF21G71C，给药3天后所有的突变体都表现出显著的降低血糖和甘油三酯水平的作用。在7天给药结束后，血糖和甘油三酯水平逐渐恢复到给药前水平，但是FGF21G71C所显示的降糖作用相比FGF21 WT稍好。更重要的是，PEG-FGF21G71C具有持续降息血糖和甘油三酯的作用，甚至在结束给药14天后仍然有作用。我们还观察到在给药期间小鼠的体重明显下降。对OB/OB小鼠的肝组织切片的观察中发现，存在广泛的微型或大型空泡。但是用PEG-FGF21G71C治疗后的肝脏组织切片中的肝细胞空泡显著减少，甚至是7天治疗结束后然有效果。为了证明PEG化FGF21G71C在胰岛素敏感的状态下的代谢作用，我们检测了肝脏组织的磷酸化AKT水平。结果显示，PEG化FGF21G71C作用后，P-AKT的表达水平增加。　　（六）PEG-FGF21G71C减少OB/OB小鼠的肝脏中间质性巨噬细胞浸润　　因为T2D患者的许多组织（如肝，肾和脂肪组织）都显示出的促炎性应答，所以我们研究了PEG-FGF21G71C对ob/ob小鼠的肝巨噬细胞浸润的效果。CD68阳性因子的表达是作为降低胰岛素敏感性的标志，并作为受影响组织的炎症状态。CD68在多种组织中表达，包括肝中的巨噬细胞。OB/OB鼠中存在大量的CD68阳性巨噬细胞和高表达的CD68基因。使用FGF21WT突变体治疗后，肝中CD68阳性巨噬细胞和CD68基因的表达都明显减少。与FGF21WT相比，FGF21G71C，PEG-FGF21 G71C表现出更强的抑制效果。这种效果即使在7天给药结束后仍然能观察到，体现了其长效激素共轭作用。　　结论:　　（一）通过定点突变技术得到3种FGF21突变体，通过固相PEG修饰技术得到PEG-FGF21 G71C　　（二）生物活性研究表明FGF21G71C，PEG-FGF21G71C具有与FGF21WT一致的活性，且保持了激活FGF21下游信号通路能力。热稳定性表明FGF21G71C，PEG-FGF21G71C较FGF21WT具有更好的稳定性。　　（三）药代动力学研究表明，FGF21 G71C，PEG-FGF21G71C具有更长的半衰期，更易于在组织中积累。　　（四）在OB/OB鼠中研究表明，FGF21突变体及PEG化具有更强的降血糖和甘油三酯的作用，且更能减少炎症反应，并且PEG-FGF21G71C在给药结束后仍然保持作用。