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研究背景和目的研究表明,在各种急慢性肝病中,凋亡是肝细胞损害的基本特征,它可能是不同类型肝病肝细胞死亡的最终通路,如酒精性肝病、病毒性、自身免疫性肝炎、胆汁淤积性肝病、肝脏代谢性疾病等。通过药物抑制肝细胞的凋亡,减轻肝细胞的损伤,保护肝细胞是治疗肝病的一个重要的研究方向。胆汁淤积性肝病是由于肝细胞分泌受损使肝毒性胆汁酸在肝细胞内增多引起的。尽管在胆汁於积时肝细胞受损的机制是多因素的,但疏水性胆汁酸诱导的凋亡可能是一个主要的作用。在体内外实验中,疏水性的胆汁酸被证实可以诱导肝细胞的凋亡。比如,给予50μmol/L脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)8h后,原始的大鼠肝细胞的凋亡率可达20%。肿瘤抑制蛋白p53是一个转录因子,调节有关细胞周期停滞和细胞凋亡基因的表达。最近研究表明,p53可能是通过转录依赖和转录不依赖的机制诱导细胞凋亡。普遍认为p53发动凋亡是通过作为序列特异性的转录激活因子活化了前凋亡基因,如Bax、Noxa和PUMA等。这些蛋白转位到线粒体,从而降低线粒体膜电位和促进细胞色素c的释放,进而活化了Apaf-1/Caspase-9的凋亡级联反应。熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)是一亲水性二羟胆酸,具有利胆、细胞保护、拮抗疏水性胆汁酸的细胞毒性、抗凋亡、抗氧化和免疫调节等作用。大量的临床研究表明UDCA对多种胆汁淤积性肝病如原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎和肝内胆汁淤积症等具有显著的疗效。体内外实验证明,UDCA保护肝细胞损伤主要是通过抗凋亡作用,而其确切机制还不是很清楚。本研究以大鼠骨髓基质干细胞诱导定向分化21天后的肝细胞为模型探讨UDCA在肝细胞凋亡过程中的作用及其作用机制。研究方法从大鼠股骨骨髓中分离骨髓基质干细胞,在体外诱导分化为成熟的肝细胞。用PBS(作为对照组),100μmol/LDCA,100μmol/LDCA+100μmol/LUDCA及100μmol/L UDCA分别处理肝细胞。用Hoechst 33258染核和测定Caspase 3的活性来评估肝细胞的凋亡程度;用RT-PCR和Realtime PCR检测凋亡过程中p53及BaxmRNA的表达;用免疫组化的方法检测凋亡过程中Bax蛋白的表达。研究结果1、DCA可以诱导肝细胞凋亡用Hoechst33258染核对细胞的凋亡进行评估,相对于对照组,肝细胞在DCA作用8h和18h后出现了明显的凋亡(p＜0.05)。同样,Caspase3活性在DCA的作用8h和18h后也明显增高(p＜0.05)。可见,DCA可以诱导肝细胞的凋亡。2、UDCA可以抑制DCA诱导的肝细胞凋亡用Hoechst33258染核对细胞的凋亡进行评估,UDCA的给予则可以明显抑制DCA诱导的肝细胞凋亡(p＜0.05)。而UDCA的同时给予则可以明显的抑制DCA诱导Caspase3活性的升高(p＜0.05)。可见,UDCA可以抑制DCA诱导的肝细胞凋亡。3、UDCA可以抑制DCA诱导的肝细胞凋亡过程中p53及Bax mRNA和Bax蛋白的表达用Realtime PCR方法分析各个实验组在作用8h和18h后,p53及Bax的mRNA的表达情况。可以发现,在加DCA后,无论是8h还是18h,相对于对照组,肝细胞的p53及BaxmRNA表达都明显增加(p＜0.05);而同时加入UDCA可以发现p53及Bax的表达明显减少(p＜0.05)。同时还用RT-PCR的方法检测了Bax mRNA的表达,其结果和Realtime PCR的是一致的。用免疫组化方法检测各个实验组在作用8h和18h后Bax蛋白的表达。相对于对照组,DCA作用组的Bax蛋白的表达明显增加(p＜0.05);而同时加入UDCA可以发现Bax蛋白的表达明显减少(p＜0.05)。由此可见,DCA可能是通过活化p53/Bax信号途径诱导肝细胞的凋亡,而UDCA可能是通过抑制p53/Bax信号通路而阻止DCA诱导的肝细胞的凋亡。研究结论1、在由骨髓基质干细胞诱导的成熟肝细胞上,DCA可以诱导肝细胞的凋亡,而UDCA可抑制DCA诱导的肝细胞凋亡。2、DCA可能是通过活化p53/Bax信号途径诱导肝细胞的凋亡,而UDCA可能是通过抑制p53/Bax信号通路而阻止DCA诱导的肝细胞的凋亡。