锦鲤鳍条细胞系的建立及其生物学特性分析

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本文采用组织块法,对来源于锦鲤(Cyprinuscarpio)的鳍条、吻端、肌肉、心脏、鳔、肠道、卵巢等组织在25℃下,添加20%胎牛血清、0.2μg/mL表皮生长因子(EGF)和25ng/mL成纤维生长因子(FGF)的L-15培养基中启动原代培养。每日观察组织块,鳍条、心脏、鳔、吻端、肌肉、肠道、卵巢分别在原代培养第3、6、12、13、15、3、3d,有细胞从组织块迁出。  当原代细胞80%铺满瓶底时,用0.25%EDTA-胰蛋白酶溶液进行消化传代。肌肉细胞传至第4代,心脏细胞在第2代时,由于细胞数量少,并且细胞不能快速增殖,使得传代不能继续。而鳍细胞在经过多次传代以后,细胞状态稳定,在一年多时间里传代至79代,建立了来源于锦鲤的鳍条细胞系,命名为KCF。KCF的最适生长温度为25℃,最适生长培养基为添加10%胎牛血清(FBS)的L-15培养基。5代以前,KCF细胞形态为成纤维状和上皮状混合型,传至30代以后,细胞形态主要为上皮状。整个传代培养过程中,KCF细胞均以1∶2的比率进行传代,但是在细胞不同时期形成细胞单层的时间不同,KCF细胞在15代以后,增殖速度快,传代后第2d即可达到亚融合状态,3~4d细胞可形成致密单层。KCF细胞在60代以后,增殖缓慢,大约1个星期才可形成细胞单层。  对冻存6个月2nd、14th、40th、68th的KCF细胞进行复苏,并用台盼蓝染色计数,其存活率约为62%、92%、95%、98%。复苏以后的活细胞贴壁以后生长良好,增殖能力强,细胞在经过冻存和复苏后,生长率和倍增时间均未发生变化。KCF传代培养细胞在四种不同培养基(M199、MEM、RPMI1640、L15)、四种不同胎牛血清浓度(0%、5%、10%、20%)以及五种不同温度(15℃、20℃、25℃、30℃、37℃)条件下的生长特性研究结果表明,L-15培养基、10%血清、25℃温度为KCF细胞系的最适培养条件。分别对第6代和第59代锦鲤鳍条细胞进行染色体核型分析,其染色体条数的最高峰都为100,即2n=100。  病毒敏感性实验结果表明,KCF细胞对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)和鲤春病毒血症病毒(SVCV)敏感,且在24h内出现细胞病变(CPE),但对斑点叉尾鮰病毒(CCV)不敏感。GCRV在KCF细胞上的滴度为106.6TCID50/0.1mL,SVCV在KCF细胞上的滴度为105.3TCID50/0.1mL。
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