引言肝癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。在我国,肝癌占恶性肿瘤死亡率的第一或第二位,全球每年新发病例约45%在我国大陆地区,发病年龄趋于年轻化。目前肝癌临床以综合治疗为主,但肝癌细胞多药耐药(multidrug resistance,MDR)严重限制了治疗的效果。有资料显示90%以上肝癌病人的死因与MDR有关,因此如何逆转肿瘤MDR,提高肝癌有效治疗是一个亟待解决的问题。肿瘤MDR理想的逆转方法应该具有高效、无毒和靶向性(能特异性地作用于肿瘤而对正常组织无损害)的特点,然而现在的研究与此标准差距尚远。因此进行肝癌MDR系列研究,探讨新的逆转手段成为提高肿瘤控制的关键,具有非常重要的现实意义和应用价值。本课题共分四部分进行实验研究。建立人肝癌MDR细胞模型和裸鼠皮下移植瘤模型,利用声学微泡联合超声靶向介导mdr1、mrp耐药基因的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASON)转染,探讨对人肝癌细胞和移植瘤MDR的逆转效应和机理,力求寻找一种低毒、高效和靶向的逆转肝癌MDR的新方法,为提高肝癌综合治疗效果,开展临床肝癌基因治疗和高剂量冲击化疗提供理论依据。本研究将分子生物学寡核苷酸反义技术和声学微泡并超声治疗技术结合,借助声学微泡并超声的空化效应,以促进基因在肿瘤细胞的高效和靶向转染及表达,提高对MDR的逆转效率,在策略和技术上是一种创新。第一部分肝癌MDR细胞模型建立和生物学特性研究第一节顺铂递增加量-间歇作用法建立QGY肝癌MDR细胞模型及生物学特性鉴定目的:建立人肝癌QGY多药耐药细胞模型并初步检测其耐药特性。方法:以人肝癌细胞株QGY为亲本细胞,选用化疗药物顺铂(cisplatin,CDDP),以低浓度递增加量-间歇作用法诱导细胞耐药。光镜、电镜观察新建细胞株组织形态学及超微结构特点。测定细胞倍增时间并绘制生长曲线、观察细胞克隆形成和流式细胞仪(Flow Cytometry,FCM)检测细胞周期分布,鉴定新建细胞生物学特性。四甲基偶氮唑盐( 3-4,5-dimethyIthiazol-z-yl-2,5-dipheny tretrazolium bromide , MTT )法测定细胞药物敏感性,免疫组化(immunohistochemistry assay)检测细胞耐药蛋白P-gp、MRP和LRP,凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果:历时15周多,成功建立MDR细胞株QGY/CDDP。QGY/CDDP在组织形态学及超微结构上与亲本细胞QGY无明显差别。一般生物学特性:MDR细胞的群体倍增时间较亲代细胞延长25小时多,克隆形成率明显低于亲本细胞,G0/G1期细胞比例增加,S期和G2/M期细胞比例下降,与亲本细胞QGY比较有显著性差异(P<0.05)。药敏检测显示:QGY/CDDP细胞对CDDP高度耐药,耐药指数(resistance index,RI)为10.35,对ADM(阿霉素)、5-Fu(5-氟脲嘧啶)和AsT(三氧化二砷)也产生耐药性,RI分别为5.50、8.51和9.23。免疫组化结果为MRP染色阳性细胞率最高,为23.89%,P-gp染色阳性细胞率为13.26%;LRP、Bcl-2和Bax染色阳性细胞率与亲本细胞接近。结论:新建细胞株QGY/CDDP具有MDR特性,其耐药机制由MRP和P-gp介导,以MRP介导机制为主,LRP、Bcl-2/Bax可能不参与QGY/CDDP耐药性的形成。第二节X射线照射法建立HePG2肝癌MDR细胞模型及耐药性鉴定目的:建立人肝癌HepG2多药耐药细胞模型并初步检测其耐药特性。方法:以人肝癌细胞株HepG2为亲本细胞,给于6MV直线加速器X-射线照射,诱导细胞耐药。HepG2细胞受X射线累积量照射后,接种到含浓度0.4μg/ml阿霉素(adriamycin,ADM)培养基中培养,发现细胞良好稳定增殖生长,提示细胞对抗ADM的细胞毒作用,即将新建细胞株命名为HepG2/ADM。光镜、电镜观察新建细胞株组织形态学及超微结构特点。测定细胞贴壁率、细胞克隆形成率和FCM检测细胞周期分布观察HepG2/ADM生物学特性。MTT法检测HepG2/ADM细胞药物敏感性,免疫组化测定细胞耐药蛋白P-gp、MRP、LRP以及凋亡蛋白Bcl-2/Bax表达,FCM测定细胞Rh123摄入和外排能力,间接检测P-gp和MRP功能。结果:历时45天多,X-射线照射累积剂量为24GY,处理后细胞能在含0.4μg/mlADM培养基中生长,即成功建立MDR细胞株HepG2/ADM。HepG2/ADM组织形态学及超微结构与亲本细胞HepG2无明显差别。一般生物学特性:HepG2/ADM细胞贴壁率、克隆形成率明显降低,G0/G1期细胞比例增加,S期及G2/M期细胞比例减少,与亲本细胞比较有显著性差异(P<0.05)。药敏检测显示:HepG2/ADM细胞对ADM高度耐药,RI为30.31,同时对CDDP、5-Fu和AsT也产生了耐药性,RI分别为6.12、6.94和9.15。免疫组化染色可见P-gp阳性染色细胞率最高,为85.62%,MRP阳性染色细胞率为12.36%,LRP阳性染色细胞率与亲本细胞接近,Bcl-2与Bax阳性染色细胞率分别为27.35%、6.25%,Bcl-2/Bax比值增高,较亲本细胞HepG2有显著性差异(P<0.05)。结论:新建细胞株HepG2/ADM具有MDR特性,其耐药机制由P-gp、MRP介导和凋亡蛋白Bcl-2/Bax共同作用,以P-gp介导机制为主。第二部分声学微泡联合超声靶向介导耐药基因ASON转染逆转肝癌细胞MDR的效应和机制目的:初步讨论声学微泡联合超声靶向介导耐药基因ASON转染逆转QGY/CDDP、HepG2/ADM人肝癌细胞株MDR的效应和作用机制。方法:取对数生长期细胞,调整成单细胞悬液,分别给于mdr1-ASON+声学微泡+超声、mrp-ASON+声学微泡+超声实验处理,待细胞生长良好,进行各项指标检测:在QGY/CDDP细胞,MTT法测定细胞耐药性变化,细胞贴壁率测定、细胞周期分布检测(FCM)、细胞凋亡TUNNEL法测定,观察细胞接受实验处理后的生物学特性变化,RT-PCR检测mdr1、mrp基因的mRNA表达,Western-blot测定细胞P-gp、MRP蛋白表达,免疫组化测定细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达。在HepG2/ADM细胞,AO/EB荧光法测定细胞凋亡,其它检测方法与QGY/CDDP实验处理后细胞检测一致。结果:QGY/CDDP细胞对CDDP、ADM、5-FU和AsT四种药物的耐药性有一定下调,RI降低:mdr1-ASON处理中,与对照组比较无显著性差异(P>0.05);mrp-ASON处理中,与阴性对照组比较有显著性差异(P<0.05),与阳性对照组比较无显著性差异(P>0.05)。mdr1-ASON转染后,细胞周期分布、P-gp、MRP的相对表达量和凋亡蛋白阳性细胞百分率的变化均较小,但与对照组比较差异无显著性(P>0.05);在细胞贴壁率、凋亡细胞TUNNEL法测定结果和耐药基因mRNA的相对表达量有一定变化(P<0.05)。mrp-ASON转染后,细胞贴壁率、细胞周期分布、TUNNEL法测定凋亡细胞、耐药基因mRNA的相对表达和P-gp、MRP的相对表达六项指标均有一定变化,有显著性差异(P<0.05);凋亡蛋白免疫组化结果一项变化较小。HepG2/ADM细胞实验处理后,细胞药物敏感性、细胞贴壁率、细胞周期分布、凋亡细胞、耐药基因mRNA表达、耐药蛋白的相对表达量和凋亡蛋白阳性细胞百分率等共七项检测指标均显示细胞有一定的变化,且与对照组比较有显著性差异(P<0.05);同样可见mdr1-ASON处理中,细胞的指标变化大于mrp-ASON处理。结论:mdr1-ASON+声学微泡+超声照射与mrp-ASON+声学微泡+超声照射能够部分逆转QGY/CDDP、HepG2/ADM人肝癌细胞的MDR。声学微泡结合超声比阳离子脂质体结合超声有更好的转染基因ASON靶向介导作用,显示对肝癌细胞株MDR更强的逆转效应。在QGY/CDDP细胞,mrp-ASON转染逆转MDR的作用明显强于mdr1-ASON转染;在HepG2/ADM细胞,mdr1-ASON、mrp-ASON转染均有较强逆转肿瘤MDR的作用,mdr1-ASON转染的MDR逆转作用更强。第三部分裸鼠肝癌MDR移植瘤模型的建立和生物学特性研究目的:建立人肝癌QGY/CDDP、HepG2/ADM多药耐药的裸鼠移植瘤模型并鉴定其耐药特性。方法:取对数生长期QGY/CDDP、HepG2/ADM细胞,调整为单细胞悬液,按实验分组,采用细胞悬液皮下直接注射法,将MDR肿瘤细胞接种在裸鼠皮下,观察肿瘤生长并记录。待皮下移植瘤生长到一定大小,各组随机取两只裸鼠处死,剥离移植瘤组织块,提取移植瘤细胞培养,待细胞处于对数生长期进行耐药性检测。光镜、电镜观察移植瘤细胞组织形态学和超微结构特点。进行移植瘤细胞倍增时间并绘制生长曲线和细胞克隆形成率测定,观察移植瘤细胞的生物学特性。MTT测定移植瘤细胞药物敏感性,FCM检测移植瘤细胞P-gp、MRP表达,Western-blot测定细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达。结果:QGY/CDDP、HepG2/ADM荷瘤裸鼠的平均生存期为40±15d,移植瘤生长体积统计分析结果:两株细胞移植瘤生长均较其对应非耐药移植瘤细胞慢,有显著性差异(P<0.05)。MDR移植瘤细胞的组织形态学及超微结构与对应非耐药移植瘤细胞无明显差异。移植瘤细胞的生物学特性检测:两株细胞均呈现细胞倍增时间延长(P<0.05),细胞克隆形成率降低(P<0.05)。MTT法结果:两株MDR移植瘤细胞均对ADM、CDDP、5-FU和AsT四种药物耐药,QGY/CDDP移植瘤细胞对CDDP的RI最高,HepG2/ADM细胞对ADM的RI最高,与各自非耐药移植瘤细胞比较差异具有显著性差异(P<0.05)。耐药蛋白与凋亡蛋白测定结果:在QGY/CDDP移植瘤细胞,MRP蛋白染色阳性细胞率最高,为23.85%(P<0.05),P-gp染色阳性细胞率为7.44%(P<0.05);Bcl-2和Bax的相对表达与移植瘤QGY细胞接近(P>0.05)。在HepG2/ADM移植瘤细胞,P-gp蛋白染色阳性细胞率最高,为84.97%,MRP染色阳性细胞率为10.26%,Bcl-2和Bax的相对表达与移植瘤HepG2细胞比较有显著性差异(P<0.05)。结论:成功建立人肝癌QGY/CDDP、HepG2/ADM裸鼠皮下移植瘤模型。其耐药机制可能主要与mdr1及蛋白P-gp、mrp及蛋白MRP(P190)和凋亡蛋白Bcl-2/bax的表达有关。本移植瘤模型成功率高,可重复性强,生物学特性稳定。第四部分声学微泡联合超声靶向介导耐药基因ASON转染逆转裸鼠肝癌移植瘤MDR的效应和机制目的:初步探讨声学微泡联合超声靶向介导耐药基因ASON转染在体逆转裸鼠肝癌移植瘤MDR的效应及其作用机制。方法:对于肝癌MDR移植瘤裸鼠,按实验分组在体给于实验处理: QGY/CDDP移植瘤给于mrp-ASON+声学微泡+超声, HepG2/ADM移植瘤给于mdr1-ASON+声学微泡+超声,并以相应ASON+阳离子脂质体+超声为阳性对照,相应MDR移植瘤+转染液注入为阴性对照,在体实验结束处死裸鼠,剥离移植瘤块,提取相应移植瘤细胞培养。取对数生长期培养细胞进行MTT药敏检测、RT-PCR测定细胞mdr1及mrp基因mRNA表达、Western-blot检测细胞P-gp及MRP蛋白表达、免疫组化测定细胞凋亡蛋白bcl-2及bax表达和移植瘤细胞膜ATPase活性变化测定。结果:裸鼠肝癌移植瘤在体实验处理后,移植瘤细胞检测发现:mrp-ASON+声学微泡+超声作用QGY/CDDP移植瘤后,与阴性对照组比较,移植瘤细胞对CDDP、ADM、5-FU和AsT四种药物的耐药性明显下调(P<0.05),与阳性组比较,耐药性有一定下调,但差异无显著性意义(P>.05),RI降低。RT-PCR显示:移植瘤细胞mrp基因的mRNA表达下降明显(对mdr1基因的mRNA表达影响较小),较对照组有显著性差异(P<0.05)。Western-blot结果:移植瘤细胞P-gp、MRP表达均有一定下降(MRP绝对值大于P-gp),与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。凋亡蛋白的免疫组化结果表明:移植瘤细胞bcl-2、bax有一定变化,与对照组比较差异无显著性意义(P>0.05)。细胞膜ATPase活性变化测定可见:移植瘤细胞的细胞膜ATPase活性有一定上调,但与对照组比较差异无显著性意义(P>0.05)。mdr1-ASON+声学微泡+超声作用HepG2/ADM移植瘤后,移植瘤细胞对ADM、CDDP、5-FU和AsT四种药物耐药性明显下调,与对照组比较有显著性差异(P<0.05),RI降低。RT-PCR显示:移植瘤细胞mdr1基因和mrp基因的mRNA表达明显下降,较对照组有显著性差异(P<0.05)。Western-blot结果表明:移植瘤细胞P-gp、MRP表达明显下降(P-gp绝对值大于MRP),与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。凋亡蛋白的免疫组化测定结果显示:移植瘤细胞bcl-2、bax明显变化,较对照组有显著性差异(P<0.05)。移植瘤细胞膜ATPase活性变化检测结果可见:细胞膜ATPase活性有一定上调,与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。结论:ASON+声学微泡+超声照射能够在体逆转裸鼠肝癌移植瘤的MDR,声学微泡联合超声比阳离子脂质体结合超声有更好的转染基因ASON的靶向介导作用,显示对肝癌裸鼠移植瘤MDR更强的逆转效应。分析这种现象的可能原因是:超声的照射导致微泡破裂,微泡破裂的空化效应促进了ASON在细胞的转染与表达。裸鼠肝癌移植瘤QGY/CDDP的MDR形成主要是mrp介导机制,与mdr1介导机制和细胞抗凋亡增强机制关系不大,相应逆转细胞MDR的作用是通过下调细胞mrp及其编码蛋白MRP表达来实现的。移植瘤HepG2/ADM的MDR形成是mdr1介导机制、mrp介导机制和细胞抗凋亡增强机制共同作用的结果,以mdr1介导机制为主,相应逆转细胞MDR的作用是通过降低三机制的作用,尤其是下调mdr1及其编码蛋白P-gp表达来实现。小结1.采用CDDP低浓度递增加量-间歇作用法、直线加速器X-射线照射法分别建立了两株MDR细胞模型:QGY/CDDP和HepG2/ADM。两种细胞都具有较高的MDR特性,QGY/CDDP细胞对CDDP、ADM、5-FU和AsT的耐药指数分别为10.35、5.50、8.51和9.23;HepG2/ADM细胞对CDDP、ADM、5-FU和AsT的耐药指数分别为6.12、30.31、6.94和9.15。2. QGY/CDDP细胞的MDR机制主要是由mrp及其编码蛋白MRP介导,与mdr1介导机制和细胞抗凋亡增强机制关系不大。HepG2/ADM细胞的MDR机制是由mdr1及其蛋白P-gp介导、mrp及其蛋白MRP介导和细胞抗凋亡增强共同发挥作用,但以mdr1及其蛋白P-gp介导机制为主。3.用mdr1、mrp-ASON+声学微泡+超声照射能够部分逆转人肝癌细胞QGY/CDDP、HepG2/ADM的多药耐药,声学微泡联合超声比阳离子脂质体结合超声有更好的转染耐药基因ASON的靶向介导作用,显示出对肝癌细胞株MDR更强的逆转效应。对于QGY/CDDP细胞逆转MDR的作用,mrp-ASON转染明显强于mdr1-ASON转染。对于HepG2/ADM细胞,mdr1-ASON、mrp-ASON转染均有较强逆转肿瘤MDR的作用,mdr1-ASON转染的MDR逆转作用更强。4. MDR肝癌单细胞悬液直接裸鼠皮下注射法接种,能够建立人肝癌裸鼠QGY/CDDP和HepG2/ADM移植瘤模型。移植瘤细胞有高度耐药特性:QGY/CDDP移植瘤细胞对CDDP、ADM、5-FU和AsT的RI依次为9.28、4.50、7.52和8.36;HepG2/ADM移植瘤细胞对CDDP、ADM、5-FU和AsT的RI依次为6.05、27.94、6.73和8.96。5.用mrp-ASON+声学微泡+超声照射能够在体部分逆转人肝癌QGY/CDDP细胞裸鼠移植瘤的MDR,用mdr1-ASON+声学微泡+超声照射能够在体部分逆转人肝癌HepG2/ADM细胞裸鼠移植瘤的MDR;其中声学微泡联合超声比阳离子脂质体结合超声有更好的转染基因ASON的靶向介导作用,显示出对移植瘤MDR逆转效应更强。6.声学微泡联合超声靶向介导耐药基因-ASON转染逆转人肝癌细胞株和移植瘤MDR的可能主要机制是封闭或下调mdr1、mrp及编码蛋白的表达,进而降低细胞耐药性。其它机制可能包括提高细胞对药物的敏感性、提高细胞膜ATPase活性,促进细胞对药物的摄取,上调细胞内药物浓度和改变凋亡基因的表达,使Bcl-2/Bax比例下调等等。声学微泡造影剂联合超声较阳离子脂质体结合超声靶向介导耐药基因ASON转染具有更好的逆转MDR效应的可能原因是:低强度超声照射导致微泡破裂,微泡破裂的空化效应促进了ASON在细胞的转染与表达,进而表现MDR细胞株和移植瘤的耐药性下降。