1研究背景和目的食管癌(Esophageal cancer, EC)是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一,预后极差,中晚期患者5年生存率仅15%左右。因早期EC无明显特异性症状,临床上95%以上EC患者首次确诊时已是中晚期。令人惊奇的是,我们研究小组在EC高发区现场随访普查中发现,一部分中晚期EC患者可长期生存达10年(超长期生存,ultra-longer survival, ULS)。这种现象的机制尚不清楚。进一步分析发现无淋巴结转移和发病年龄早是食管癌患者超长期生存的重要影响因素。很显然,阐明中晚期超长期生存食管癌患者的分子和免疫功能变化特征和规律对揭示这一独特现象的分子机制和临床应用均具有重要意义。本研究组已完成2.5万例EC和对照组全基因组关联分析(GWAS)研究,发现2个EC易感基因(自然-遗传,2010),证明了遗传的分子基础,但尚未阐明GWAS发现的单核苷酸多态(SNPs)与EC生存关系。近年肿瘤免疫研究提示机体免疫状态与肿瘤发生、发展密切相关。因此,本研究拟从SNP遗传变异和免疫功能状态角度探讨EC患者超长期生存相关分子机制,即,(1)对比分析短期生存和ULS的EC患者临床病理变化,揭示ULS患者临床病理特征及相关影响因素；(2)在本实验室前期已完成的1,077例EC病例和1,073例对照人群的GWAS初筛数据基础上,选择初筛发现的40个生存相关SNPs,在3,921例有生存随访的EC患者中进行基因分型验证,并运用Cox多因素回归模型分析不同基因型与患者生存时间关系；(3)采用流式细胞分析(flow cytometer,FCM)和口免疫组织化学(immunohistochemisty, IHC)技术对相关免疫分子在EC患者外周血及肿瘤组织中进行验证,确定食管癌预后相关免疫分子。2研究对象2.1超长期食管癌患者临床病理特征及影响因素分析：从本室已建立的超长期和短期EC资料库中,根据明确病理诊断、治疗方式、生存期随访结果及问卷调查,最后选定30,718例EC患者进入分析。其中ULS患者7,180例；短期生存患者23,538例。2.2基于GWAS初筛数据的生存期相关SNPs分析：进入GWAS研究对象共6,047例。其中初筛2810例(病例组1077例,对照组1733例)；验证3,921例,(男性2,406例,中位生存时间3.05年；女性1,515例,中位生存时间6.93年),均为中国汉族人。采集每位患者及正常对照3-5ml外周静脉血,-20℃储存。2.3外周血中生存相关免疫分子分析：进入流式细胞分析的研究对象共278例,包括218例EC患者(现症病人组48例,男性35例,女性13例；短期生存组45例,男性28例,女性17例；生存期5-10年组34例,男性19例,女性15例；ULS组91例,男性52例,女性39例)和60例健康对照者(男性24例,女性36例)。肝素钠抗凝管采集每位患者及正常对照外周静脉血10ml,无菌操作。2.4组织微环境中生存相关免疫分子分析：进入免疫组织化学分析的研究对象共225例,包括75例癌旁组织和150例EC组织,168例手术切除标本来自EC高发区、低发区57例,EC家族史阳性者70例、家族史阴性者155例。3研究方法3.1问卷调查、随访及病理诊断和治疗情况复核通过对河南安阳、林州、鹤壁、新乡等EC高发区进行EC现场流行病学调查,确定EC患者,进行入户问卷调查和随访,记录患者一般资料(年龄,性别,家族史,治疗医院等)。最终进入本研究分析的患者均经入户调查和随访。随访截止时间为2013年3月15日。根据患者口述治疗医院和时间,到相应治疗医院对患者临床病理资料(以病理诊断为准)包括患者确诊时间、病理诊断、组织类型、分化程度、TNM分期、淋巴结转移、治疗情况(外科手术、化疗、放疗)；一般体格检查(身高、体重、血压等)进行复核,未找到原始住院记录者,不进入最终分析。采用SPSS19.0统计软件处理数据,组间比较采用卡方检验,Cox比例风险回归模型进行多因素生存分析,检验水准取a=0.05。3.2GWAS筛选生存相关SNPs用德国QIAGEN基因组DNA提取试剂盒提取血液样本基因组DNA,准确测定每份待标化样本DNA的浓度,用于初筛的DNA浓度保持在50ng/μl, OD值在1.8-2.0之间,用于验证的DNA浓度保持在15ng-20ng/μl,OD值在1.7-2.0之间。初筛选用Illumina Human610-Quad芯片,验证选择Sequenom iPLEX芯片。计算样本得率、SNP得率、最小等位基因频率(minor allele frequency, MAF)、哈迪·温伯格(Hardy-Weinberg;HWE)平衡律。对质控后的数据用Plinkl.03软件分析并输出结果,用Cochran-Armitage趋势检验计算P值、优势比(Odds ratio,OR)和95%可信区间(95%confidence interval,95%CI)。数据分析使用SPSS19.0统计软件处理,进行卡方检验、Kaplan-Meier生存分析、Cox多因素回归模型分析不同基因型与患者生存时间关系,检验标准取α=0.05。3.3FACS检测外周血中生存相关免疫分子FACS检测278例研究对象外周血中PD-1,TIM-3,D27表达。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测其外周血中细胞因子IL-2,IL-10,TNF-α,IFN-γ浓度。采用t检验、方差分析确定差异显著性,检验水准取a=0.05。3.4IHC检测肿瘤微环境中生存相关免疫分子应用ⅠHC检测组织芯片上EC癌和癌旁组织中PD-1,TIM-3,CD27表达。SPSS19.0统计软件处理,组间比较采用卡方检验,检验标准取α=0.05;Cox多因素回归模型分析肿瘤微环境中PD-1,TIM-3,CD27蛋白表达与患者生存时间关系。4结果4.1ULS患者临床病理分析30,718例符合条件EC患者进入最终分析。其中ULS患者7,180例,男4,053例,平均诊断年龄55±9.6,女3,127例,平均诊断年龄56±8.4；短期生存患者共23,538例,其中男15,554例,平均诊断年龄61±9.3；女7,984例,平均诊断年龄62±9.4。临床病理资料分析发现ULS者中肿瘤分期为中晚期者占91%(2,994/3,313),中分化者占59%(1,208/2,067),T3浸润者占75%(1,387/1,842)、淋巴结转移阴性者占67%(2,168/3,212)、手术治疗者占80%(2,955/3,705)、EC家族史阴性者占60%(2,804/4,381)、ULS者≥56岁者占72%(5,195/7,180)、男性患者占56%(4,053/7,180)。对比分析发现ULS中的中晚期患者发生率低于短期生存者(91%vs.96%,?=69.09,P<0.05)；ULS中的高分化患者比短期生存者多两倍(28%vs.10%, x2=614.16,P<0.05);T3浸润发生率低于短期生存者(75%vs.86%,x2=16.55,P<0.05)；家族史阳性明显高于短期生存者(40%vs.29%,x2=68.98,P<0.05)；手术治疗多于短期生存者(80%vs.60%,x2=390.61,P<0.05);ULS中≤5岁男性发病率是短期生存者≤5岁发病者的2倍(8.7%vs.3.5%),女性患者约为4倍(6.7%vs.1.7%)。Cox多因素生存分析显示性别、年龄、分化程度为ULS食管癌患者预后的重要独立影响因素：女性预后明显优于男性(RR=1.68；95%CI:1.19-2.34)；与≤45岁患者相比,≥56岁患者为生存期差危险因素(RR=0.82;95%CI:0.46-0.94);与高分化相比,中、低分化患者生存期差(HR=0.39,0.38;95%CI:0.19-0.82,0.19-0.74,)。患者肿瘤浸润深度、有无淋巴结转移、治疗方式及家族史不是ULS患者预后独立影响因素。4.2EC患者生存相关SNPs通过初筛分析筛选出的40个有价值的SNPs (p≤1X10-7),在3,921例样本中进行了高通量生存验证,结果显示其中3个SNPs是ESCC患者预后危险因素：携带rs1AA、GG和GA基因型、携带rs2AA、GA和GG基因型及携带rs3CC, CT和TT基因型的患者生存时间有差异(x2=12.258,8.399,6.671;P=0.002,0.015,0.036)。校正性别、年龄、吸烟、饮酒和临床分期等可能混杂因素后Cox多因素生存分析显示rs1、rs2、rs3变异均不是EC患者生存预后的独立影响因素(P=0.43,0.52,0.21)。分析了目标SNP和其相关区域重组和链锁不平衡类型之后,3个SNPs位点分别定为于lp36.31-p36.23的CAMTA1基因、1p36.33的cyclin L2基因和1lql4.1的TENM4基因上。4.3外周血中免疫分子分布及与临床病理相关分析与健康对照组相比,短期生存、ULS者外周血中PD-1,TIM-3高表达,CD27低表达,差异有统计学意义(P=3.55E-28,1.06E-37,1.57E-5)。PD-1表达与性别、年龄和肿瘤分期相关(P<0.05),即肿瘤分期为中晚期、男性、>56岁患者,PD-1高表达；TIM-3、CD27表达与年龄相关(P<0.05),即随着年龄增长,TⅠM-3高表达,CD27低表达。细胞因子IL-10,TNF-a, IFN-γ在不同预后EC组、健康对照组间有差异性表达(p=4.44E-5,1.97E-5,0.003);IL-2表达无差异(p=0.323)。4.4肿瘤微环境中免疫分子分布及与临床病理和患者预后关系TIM-3,PD-1,CD27在短期生存、ULS及对照组间有差异性表达(p=0.000,1.54E-12,0.001)。进一步两两比较发现TIM-3,CD27的表达在短期生存、ULS组间没有显著性差异(p=0.611,0.242),PD-1的表达在SS、ULS组间有显著性差异(p=4.95E-4),SS、ULS组分别与对照组相比,其差异也有统计学意义(p=4.38E-14,9.75E-5)。TIM-3、PD-1、CD27蛋白染色强度与EC患者的不同性别、年龄、有无家族史及高低发区无关(p>0.05)；肿瘤的浸润深度、淋巴结有无转移与PD-1蛋白染色强度有关,与TIM-3,CD27染色强度无关。T2与T3-4、N0与N1相比,蛋白染色强度有差异(x2=9.442,8.599；P=0.009,0.014),与N0相比,N1期PD-1蛋白阳性、强阳性表达率增高(47%vs35.2%,25%vs18.3%)。Kaplan-Meier生存分析显示CD27,TIM-3表达强度对EC患者预后无影响(x2=1.283,0.112;P=0.52,0.945)o PD-1阴性表达者生存期好于PD-1阳性表达者(x2=14.155, P=0.001);COX多因素生存分析显示CD27, TIM-3, PD-1表达强度不是EC患者预后独立影响因素(P=0.172,0.275,0.049)。5结论5.1ULS者以中晚期、中分化、低淋巴结转移率、T3、手术治疗、≥56岁、男性患者高发病率为主；Cox多因素生存分析显示年龄、性别、分化程度是超长期EC患者预后的重要独立影响因素。5.2rs1、rs2、rs3遗传变异是影响EC患者生存的危险因素,分别定为于1p36.31-p36.23的CAMTA1基因、1p36.33的cyclin L2基因和11q14.1的TENM4上;5.3EC患者外周血及肿瘤组织微环境中PD-1、TIM-3高表达,CD27低表达；短期生存者PD-1的表达高于超长期生存者；5.4PD-1表达与EC肿瘤浸润深度和淋巴结转移相关。生存分析显示PD-1是EC患者预后危险因素,CD27、TIM-3表达对患者预后无显著影响。