背景和目的肿瘤是危害人类生命的疾病之一，我国肿瘤引起的死亡率在所有疾病中居第1位。目前主要采用手术、放疗、化疗、生物治疗等综合措施。肿瘤化疗药物为恶性肿瘤的治疗做出了不可替代的重要贡献。但随着研究的不断深入，人们逐渐发现肿瘤化疗药物面临诸多如毒副作用、抗药性、病症不能彻底根除等问题。而传统中医药治疗注重整体，攻补兼施，副作用小，且疗效稳定持久。临床观察发现有些中药成分不仅有直接抗肿瘤作用，而且有对化、放疗减毒增效、预防肿瘤复发转移的作用。中药发挥作用的物质基础是其有效成分或单体，随着现代科学技术的广泛应用，更多的中药成分被开发成新药，应用于临床，并已成为新药研发的必然趋势。抑瘤宁为中药经验方，由Rab、Aca、Sol、Duc四味中药组成，临床治疗消化系统肿瘤，疗效肯定，无明显毒副作用。本实验前期已对四味中药粗提物体外单独和联合作用于多种消化系统肿瘤细胞进行了初步研究，结果表明抑瘤宁粗提物有较强的体外抗肿瘤作用。提示对抑瘤宁有效成分或单体抗肿瘤活性的研究和作用机制的探讨有着极大的科研价值及应用前景。目前对中药成分的研究多以单一性研究为主，虽然在体外及动物实验中显示出一定的抗肿瘤活性，但在临床应用中往往需较大剂量，疗效欠佳。多种有效单体联合应用有无协同增效作用尚无报道。经文献查阅，从Rab中选取成分Oridonin，Aca中选取ASS（Acanthopanax Senticosus），Sol中选取Solanine，Oridonin、ASS、Solanine均为纯度较高的粉制剂，而对Duc有效成分的提纯目前仍属空白。本实验从Duc中提取出Ducheside，经鉴定为Duc活性成分之一。分别以A、B、C、D代表Oridonin、ASS、Solanine、Ducheside四种药物，采用四种药物分别单用和以A为主要成分，与B、C、D进行二联、三联、四联组合，作用于人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人肺癌A549细胞、人肺癌NCI-H520细胞、人宫颈癌Hela细胞，进行体外抗肿瘤研究，探讨中药成分或单体的作用机理。并根据细胞毒性最大，药物剂量最小的原则从多次实验中筛选出最佳药物组合及最佳配伍剂量，为进一步研究抑瘤宁成分的药理学毒性及开发新药提供实验基础。方法1．实验分组。本实验分为11组，分别为A、B、C、D、A+B、A+C、A+D、A+B+C、A+B+D、A+C+D、A+B+C+D，同时设空白对照组（未加药组）。2．采用噻唑蓝（MTT）还原法测定各实验组对MDA-MB-231、A549、NCI-H520、Hela细胞的生长抑制率。取对数生长期细胞，接种于96孔板，培养24h后，将不同浓度的各组药物分别作用于MDA-MB-231、A549、NCI-H520、Hela细胞继续培养48h后，测定各组细胞生长抑制率。每个浓度设6个平行孔，重复三次。3．倒置显微镜观察各组药物作用于MDA-MB-231细胞48h后的形态学变化。4．流式细胞仪检测各组药物作用后MDA-MB-231细胞周期分布和凋亡率。5．统计学分析。采用统计软件SPSS11.0分析，用独立样本的t检验，χ²检验对统计数据进行分析，如有差异，多组间参数两两比较采用q检验。以α=0.05为检验水准。结果1．不同浓度不同药物分组的四种药物作用于体外培养的MDA-MB-231、A549、NCI-H520、Hela细胞48h后，各实验组生长抑制率结果如下：1．1 MDA-MB-231细胞：A在单药组抑制作用最强(IC₅₀=4.78μg／ml)，C次之(IC₅₀=1.15mg／ml)，B最弱(IC₅₀=2.15mg／ml)。四药联合在联合用药组各成分剂量最小（A 2μg／m+B 0.6 mg／ml+C 0.4 mg／ml+D 0.4 mg／ml），抑制作用最强。1．2 A549细胞：A在单药组抑制作用最强(IC₅₀=16.26μg／ml)，C次之(IC₅₀=0.51mg／ml)，B最弱(IC₅₀=1.92mg／ml)。四药联合在联合用药组各成分剂量最小（A 4μg／ml+B 0.2mg／ml+C 0.1mg／ml+D 0.4mg／ml），抑制作用最强。1．3 NCI-H520细胞：A在单药组抑制作用最强(IC₅₀=31.56μg／ml)，D次之(IC₅₀=0.71mg／ml)，B最弱(IC₅₀=2.43mg／ml)。四药联合在联合用药组各成分剂量最小（A 10μg／ml+B 0.6mg／ml+C 0.1mg／ml+D 0.2mg／ml），抑制作用最强。1．4 Hela细胞：A在单药组抑制作用最强(IC₅₀=23.44μg／ml)，C次之(IC₅₀=1.73mg／ml)，D最弱(IC₅₀=2.26mg／ml)。四药联合在联合用药组各成分剂量最小（A 10μg／ml+B 0.6mg／ml+C 0.4mg／ml+D 0.4mg／ml），抑制作用最强。2．药物作用后，MDA-MB-231细胞的形态学变化。倒置显微镜下观察到：对照组：MDA-MB-231细胞呈梭形，贴壁生长，细胞透亮，生长状态良好。实验组：细胞相互分离，透亮度差，贴壁大量减少，体积明显缩小，细胞皱缩，可见大量细胞崩解碎片，细胞核缩小或崩解消失。3．流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞周期分布和凋亡率。体外培养的MDA-MB-231细胞经A单药及四药联合作用后，A单药组和四联组S期细胞百分率明显升高，G₀／G₁期细胞百分率明显下降（P＜0.05）；细胞被阻滞于S期；四联组呈现凋亡所特有的亚G₁峰，凋亡率升高（P＜0.05）。结论1．种成分单用A抑制作用最强，A单药对四种肿瘤细胞中的MDA-MB-231细胞和A549细胞抑制作用较强、NCI-H520细胞和Hela细胞稍差。2．种成分联用有较强的协同作用，与单用相比，小剂量就能达到抑制作用最强。3．瘤宁四种成分的最佳配伍是以A为主的四药联用。对四种肿瘤细胞中的MDA-MB-231抑制作用相对最强，A549次之，对Hela细胞的抑制作用相对最弱。4．瘤宁四种成分单用和联用对肿瘤细胞均有增殖抑制作用，其机制可能与阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡有关。此结果对该方剂进一步的实验和临床应用具有指导意义。