论文部分内容阅读
动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种发病率比较高的心血管疾病,其发病机制很复杂,目前认为内皮功能紊乱(endothelial dysfunction)是AS发病早期过程中的一个关键因素。内皮功能紊乱是指血管内皮细胞功能上的变化,主要特征表现为NO释放量和生物利用度的降低,粘附因子的表达增加和趋化因子的表达增加等。这种分子水平的变化与循环中的血细胞及血管中的平滑肌细胞相互作用,导致血管功能及结构上的变化,继而引发了AS。内皮功能紊乱在AS的发病早期过程中起着至关重要的作用,改善内皮功能紊乱将会减少AS的发病风险。很多的研究证明通过改变生活方式和药物治疗等方法能够改善内皮功能,这些相互作用能够降低AS的发病率,主要的采用的方法有抗氧化治疗,降低血脂治疗,改变生活方式等。水蛭作为一味传统的活血化瘀,中药,具有抗凝血、抗血栓、保护细胞、抗炎以及抗肿瘤的作用,在临床上被广泛应用于包括心血管疾病(如脑梗,心梗,AS),高脂血症,肾脏疾病,妇科及男科疾病等。那么这些疾病是否有共同点来作为水蛭发挥药效的基础呢?按照现代医学的观点以及文献报道,心脑血管疾病(以AS为代表),糖尿病,肾脏疾病,男科疾病的发病基础都指向了内皮功能紊乱。我们推测对疾病中内皮功能紊乱的改善是水蛭发挥治疗作用的基础,因此本课题通过模拟人体消化过程制备水蛭酶解提取物(hirudo enzyme extracts,HEE),在体外研究了其对AS发病过程中内皮功能紊乱保护作用,并初步探索了其作用机制。主要研究内容如下：1.内皮功能紊乱模型的建立首先采用浓度为10ng/ml的TNF-α作用于血管内皮细胞Eahy9266h进行诱导,建立内皮细胞功能紊乱模型。采用RT-PCR的方法检测eNOS mRNA的表达量。eNOS含量测定结果表明与对照组相比,模型组细胞内eNOS mRNA的表达量明显增加(**p<0.01),选择该浓度为诱导浓度。采用MTT和RT-PCR实验方法筛选最佳药物作用浓度,实验结果表明在HEE浓度为50-800μg/mL时对细胞活力无影响,并剂量依赖性的上调eNOS的mRNA表达量,其中200μg/mL作用最明显,选取200μg/mL为最佳药物浓度。2.HEE对内皮功能紊乱保护作用的研究先将水蛭酶解提取物HEE作用于血管内皮细胞Eahy92624h,之后采用浓度为10ng/ml的’TNF-α诱导6h后研究HEE对内皮功能紊乱的保护作用。RT-PCR实验结果表明HEE可使eNOS mRNA表达量显著升高,而使细胞问粘附分子ICAM-1的mRNA表达量和单核细胞趋化蛋白MCP-1的mRNA表达量显著降低。Western blot实验结果表明HEE可使ICAM-1的蛋白表达量和MCP-1的蛋白表达量显著降低。NO检测试剂盒结果表明,HEE可以使NO释放量显著增多。粘附实验结果表明,HEE可以使内皮细胞对单核细胞的粘附率显著性下降。Transwell迁移实验结果表明,HEE可以使单核细胞迁移率显著性下降。3.HEE对内皮功能紊乱保护作用的机制的探讨HEE能够显著性抑制NF-κB的主要亚基p65迁移到核内,而NF-κB的活化与ICAM-1和MCP-1的表达有关,因此我们推测HEE对内皮功能紊乱的保护作用的机制为通过抑制NF-κB信号通路的活化,从而减少ICAM-1, MCP-1mRNA表达和蛋白合成。本研究表明HEE能够上调eNOS mRNA的表达量和NO释放量,下调ICAM-1和MCP-1的mRNA表达量和蛋白表达量,并且HEE还可使内皮细胞对单.核细胞的粘附率和迁移率显著性下降,抑制NF-κB信号通路的活化,从而保护了内皮功能紊乱。