研究背景：膀胱过度活动症(overactive bladder,OAB)是以尿急症为特征的症候群,伴有或不伴有急迫性尿失禁,常伴有日间尿频、夜尿症。在下尿路症状中,OAB症状最常见,且对患者的日常生活影响最大。OAB对于医疗保健系统来说也是一个沉重的负担,其社会经济花费与用于糖尿病或痴呆症的费用大致相当。近一半患者诉OAB症状显著影响日常生活。目前治疗OAB的主要药物是毒蕈碱胆碱能受体(muscarinic receptor;M受体)拮抗剂,但其作用机理仍未明确。传统理论认为,OAB症状是由逼尿肌过度活动引起的。M受体拮抗剂的作用部位是膀胱逼尿肌,即阻断膀胱逼尿肌上突触后(传出神经)M受体,进而抑制由副交感神经末梢释放的神经递质乙酰胆碱所诱导的逼尿肌收缩。但是传统理论无法解释为什么口服M受体拮抗剂在改善OAB患者的尿频、尿急等膀胱感觉症状的同时,而很少发生尿潴留?膀胱感觉与传入神经通路有关,因此有学者推测M受体拮抗剂对传入途径也有作用,这在临床和实验中都得到了支持：Fader M等发现：膀胱灌注非选择性M受体拮抗剂阿托品在增加的膀胱容量方面,与口服奥昔布宁有相等效应,但膀胱灌注组副作用更少,患者生活质量改善更明显。动物实验发现,膀胱灌注阿托品不影响正常鼠的排尿生理,即使是大剂量灌注也仅仅是降低膀胱收缩幅度而已。现在有研究提示,膀胱黏膜上皮层Ach释放增多,上皮及上皮下成肌纤维细胞M受体改变,膀胱传入神经活动增加,可能是产生OAB症状的原因。有人推测OAB患者膀胱黏膜M受体也发生了变化。M受体有M1-M5五种亚型。人膀胱黏膜表达所有的M受体亚型mRNA。但病理状态下人的膀胱黏膜M受体亚型表达的报道仍较少,且结果(见下)存在矛盾之处：Mukerji G等报道IDO (idiopathic detrusor overactivity,特发性逼尿肌过度活动)患者膀胱上皮下成肌纤维细胞样细胞M2、M3表达上调,且与尿急、尿频症状评分相关；上皮及逼尿肌M2、M3受体表达无变化。Soumendra N Datta等发现DO患者黏膜上皮下M1、M3受体表达下调,且与尿急次数和24小时排尿次数负相关；膀胱上皮M1表达下调；上皮下M2轻微下调(无统计学意义)。Kate H Moore等发现IDO女性患者膀胱黏膜M2表达无变化、M3表达下调。上述有关DO/IDO患者膀胱黏膜M受体检测的结果存在着明显的矛盾,且都有一个共同特点：那就是均来源于DO患者。DO指在储尿期膀胱压力-容积测定过程中逼尿肌出现无抑制性收缩。根据OAB的定义可以知道,诊断OAB是不需要尿动力学检查的,同时找不到明确病因才能诊断OAB。只有54.2% OAB患者尿动力学检查到DO,而仅27.5%的DO患者存在OAB症状。因此,DO不能等同于OAB。因此,DO不能等同于OAB。也就是说,迄今为止,国际上尚未有真正的有关OAB患者膀胱黏膜M受体检测的报道。研究目的和意义：对于OAB的发病机理,通常认为是逼尿肌过度活动导致尿急、急迫性尿失禁等OAB症状。所以,人们普遍推测M受体(muscarinic receptor,毒蕈碱胆碱能受体)拮抗剂的作用部位是膀胱逼尿肌,即阻断逼尿肌上的M受体,减少膀胱传出神经的活动,从而抑制逼尿肌的收缩。但是,临床上发现,口服建议剂量的M受体拮抗剂能改善OAB患者的尿频、尿急、急迫性尿失禁症状并增加膀胱容量,而很少引起排尿困难或尿潴留；此外,膀胱灌注M受体拮抗剂阿托品能明显改善逼尿肌过度活动患者症状。这说明,M受体拮抗剂治疗OAB的机理可能与抑制膀胱感觉通路(传入神经通路)有关,即与阻断膀胱黏膜M受体有关。目前对膀胱黏膜中M受体分布和功能还不清楚,仅有少数关于逼尿肌过度活动患者膀胱黏膜中M受体亚型分布的研究,但他们的研究结果存在矛盾,对其临床意义则更缺乏研究。也就是说,迄今为止,尚未有关于OAB患者膀胱黏膜M受体亚型检测的报道。综上所述,本课题观察OAB患者M1-5受体亚型在膀胱黏膜中的表达变化,评估其与临床症状、生活质量间的关系,将有助于进一步探讨OAB的发病机制及M受体拮抗剂的作用机理；对改变M受体拮抗剂给药途径,提高其疗效,降低其副作用,提高患者生活质量都有重要意义。研究方法：选择愿意参加本研究的OAB患者和无OAB症状的血尿或上尿路结石需要做膀胱镜检查的患者入组。患者来源于2010-3月-2011年3月广州市第一人民医院泌尿外科就诊的患者。将研究对象分为2个组：对照组11例、膀胱过度活动症组10例。OAB组的入选标准：(1)患者主观上存在有OAB症状(即尿急,伴或不伴有急迫性尿失禁,常伴有尿频和夜尿症),病史≥3个月；(2)尿液分析结果正常；(3)泌尿系B超检查未见异常；(4)签署知情同意书。正常对照组的排除标准：(1)有OAB症状；(2)有尿路感染患者；(3)糖尿病患者；(4)神经原性病变的患者；(5)前列腺增生症患者；(6)尿动力学检查证实有膀胱出口梗阻及可疑梗阻的患者；(7)拒绝参加本实验研究者。OAB组的排除标准：(1)有尿路感染患者；(2)糖尿病患者；(3)神经原性病变患者；(4)前列腺增生症患者；(5)尿动力学证实有膀胱出口梗阻及可疑梗阻的患者；(6)放射或化学性膀胱炎；(7)性传播性疾病；(8)半年以内使用过M受体拮抗剂药物治疗的患者；(9)拒绝参加本研究者。对照组的入选标准：(1)无OAB症状的血尿或上尿路结石患者；(2)需要做膀胱镜检查；(3)签署知情同意书。正常对照组的排除标准：(1)有OAB症状；(2)有尿路感染患者；(3)糖尿病患者；(4)神经原性病变的患者；(5)前列腺增生症患者；(6)尿动力学检查证实有膀胱出口梗阻及可疑梗阻的患者；(7)拒绝参加本实验研究者。所有患者均记录排尿日志,OABSS、King’s问卷调查表,该记录由同一医师进行,问卷调查表采用询问方式由医师进行填写,排尿日志由患者自行填写。所有标本均通过膀胱镜检活检获得,统一在膀胱左侧壁距左输尿管口头外侧2cm处取得膀胱侧壁黏膜,液氮保存。荧光定量PCR,方法：(1)组织总RNA制备：在匀浆器中加1ml Trizol试剂,活检组织充分研磨至匀浆,加200u1氯仿后离心；异丙醇沉淀RNA。加75%乙醇洗涤沉淀离心；无RNase水溶解RNA,-80℃低温冰箱保存。(2)RNA纯度及完整性鉴定：样品在Eppendorf核酸蛋白定量仪上测定OD260值及OD260、OD280比值行纯度鉴定；凝胶成像系统观察总RNA 5s rRNA、18s rRNA、28s rRNA条带行RNA完整性鉴定；(3)逆转录反应(RT)获得cDNA片段；(4)采用设计引物行荧光定量PCR反应；绘制荧光定量PCR标准曲线；确定M受体]mRNA相对拷贝数和标准化拷贝数。对OAB患者及对照组膀胱黏膜的M1-5受体mRNA标准化拷贝数进行比较。对问卷调查表结果进行评估,分析其与M受体亚型mRNA表达情况之间的相关性。结果：本研究中OAB患者10例,正常对照组11例。OAB组平均年龄38.70±10.71岁；对照组平均年龄49.64±13.11岁；组间年龄差异没有统计学意义(F=4.328,P=0.051)。对照组是女性6例,男性5例；而OAB组,女性7例,男性3例,组间性别差异比较没有统计学意义(采用Fisher确切概率法,P=0.659)1、对照组及OAB患者膀胱黏膜M受体mRNA拷贝数组内比较：如下表所示,OAB患者膀胱黏膜M受体亚型mRNA拷贝数由大到小依次为：M3>M4>M5>M2>M1。对照组组内M受体亚型mRNA拷贝数则依次为：M3> M4> M5>M1> M2。从M受体亚型mRNA拷贝数排序来讲,两组间存在差异。可以看出,在OAB组,M2受体mRNA拷贝数排序前移一位。表1 OAB患者组内膀胱黏膜的M1-M5拷贝数比较(中位数)M1 M2 M3 M4 M5 (n=10) (n=9) (n=10) (n=10) (n=10) OAB 0.27(0.21-0.55) 0.70(0.09-4.57) 46.35(11.97-168.83) 36.86(7.45-68.76) 10.13(1.66-20.87)表2：对照组内膀胱黏膜的M1-M5拷贝数比较(中位数)M1 M2 M3 M4 M5 (n 2=11) (n 2=9) (n 2=11) (n 2=11) (n 2=11)对照组0.24(0.11-0.52)0.09(0.02-1.31) 12.79(3.86-269.35) 10.79(5.03-91.02) 9.47(3.78-28.76)不管是OAB还是对照组,膀胱黏膜中都是以M3、M4、M5受体为主,其中M3受体最多。而且,M3同King’s生活质量评分第5、6部分相关,Spearman’s rho相关系数为0.788,0.654；P=0.035,0.040。2、OAB组与对照组两组间膀胱黏膜M1-M5受体mRNA拷贝数比较,采用Mann-Whitney检验,OAB与对照组膀胱黏膜M1、M2、M3、M4、M5比较,Z值分别为-0.63；-1.28；-0.63；-0.85；-0.14。P值分别为0.557；0.222；0.557；0.426；0.918。两组间M1-M5受体表达差异均没有统计学意义。3、OAB组患者M1-M5受体mRNA拷贝数与症状间的相关性比较：OAB组患者OABSS总分7.70±3.16分；OABSS尿急症状评分3.50±2.07分；King’s生活质量评分总分529.72±208.15分。M4同OABSS评分及尿急症状相关,Spearman’s rho相关系数为0.740,0.723；P=0.014,0.018。King’s生活质量评分第5部分还与M4、M5受体表达相关,Spearman’s rho相关系数为0.788,0.768；P=0.035,0.044。主要结论：1、OAB患者组组内膀胱黏膜M受体亚型mRNA拷贝数由大到小依次为：M3> M4> M5>M2>M1。对照组组内则依次为：M3>M4>M5>M1>M2。两组间M受体亚型排序存在差异。在OAB组,M2受体mRNA拷贝数排序前移一位。M受体拮抗剂托特罗定对M2受体的拮抗作用强于M3受体,本结果可能对解释托特罗定的疗效和作用机理有帮助。OAB组和对照组膀胱黏膜中都是以M3、M4、M5受体为主,其中M3受体最多。而且,M3同King’s生活质量评分第5、6部分相关,这说明临床上广泛使用的选择性M3受体拮抗剂治疗OAB时可能对膀胱黏膜也有作用。King’s生活质量评分第5、6部分分别反映了排尿症状对个人生活、情感方面的影响。这为临床上使用选择性M3受体拮抗剂来改善患者生活质量提供了理论依据。根据本研究结果,选择性M3受体拮抗剂对个人生活,情感方面的改善可能更明显。2、OAB组与对照组两组间膀胱黏膜M1-M5受体表达的差异没有统计学意义。3、OAB患者膀胱黏膜M4同OABSS评分及尿急症状相关；King’s生活质量评分第5部分还与M4、M5受体表达相关。这说明M4、M5在OAB的发病机制中也是起作用的,在以后的研究中也要关注M4、M5受体。