阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)又称老年性痴呆,是引起痴呆的重要疾病来源,随着进入老龄化社会,AD给社会和家庭带来了沉重的负担。白1906年Alois Alzheimer首次命名并报道AD以来,人们一直在寻找其发病机制及预防和治疗措施。尽管AD发病机制目前还不十分明确,但淀粉样蛋白(amyloid protein,Aβ)作为AD发病的始动因子已基本得到认可。Aβ25-35是Aβ的功能性片段,体内外实验研究显示了Aβ25-35能引起大鼠海马经元损伤、学习、记忆能力下降。临床药物对老年性痴呆的治疗效果不佳,主要以增强胆碱能神经功能药物为主,国外开发抗AD药物主要集中在通过研究AD发病的分子机制寻找新的靶点及抗氧化植物药,国内主要围绕抗氧化植物药进行开发。黄酮类化合物是自然界分布较广泛的一类次生代谢产物,是植物药抗氧化的一个重要有效成分。黄芩是我国传统的中草药,对黄芩的研究集中在其有效成分黄酮类化合物,研究表明黄芩茎叶总黄酮具有抗炎、抗免疫、保护心肌缺血再灌注损伤、减轻脑缺血引起的损伤等作用。本实验采用大鼠双侧海马内注射淀粉样蛋白(Aβ25-35)制备大鼠痴呆模型,从氧化应激、炎症反应、神经元凋亡等机制观察黄芩茎叶总黄酮(Scutellaria Baicalensis Stem-leaf Total Flavonoid, SSTF)对Aβ致大鼠学习、记忆能力损伤的影响及机制,以期为抗氧化植物药用于AD的预防、治疗提供实验依据。第一部分黄芩茎叶总黄酮对Aβ致大鼠学习记忆损伤的影响目的：观察SSTF对大鼠双侧海马注射Aβ致大鼠学习、记忆能力损伤的影响。方法：1实验分组及处理：雄性Wistar大鼠100只,随机分为对照组、模型组、SSTF低、中、高剂量组、VE组,每组16只,对照组、模型组灌胃蒸馏水,其它各组分别灌胃SSTF (25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)、VE(10mg/只),灌胃20天,在灌胃一周后对照组大鼠海马注射生理盐水,其它各组注射Aβ,注射Aβ一周后做Morris水迷宫实验,连续做6天后处死。选4只大鼠注射Aβ3天后处死,脑组织外固定后30μm厚连续震荡切片,观察针道。2模型制备：采用脑立体定位技术,于大鼠AP-3.5mm, ML±2mm, DV 2.7mm定位海马CA1区,注射凝胶态Aβ5μl含10μg。3 Morris水迷宫实验：于大鼠海马注射Aβ一周后做水迷宫实验,每天2次,连续6天,记录大鼠60秒内寻找平台的潜伏期,第6天测定大鼠寻找平台潜伏期后撤去平台,观察大鼠2分钟内穿越平台区域的次数,2分钟内在平台区象限停留的时间,2分钟内大鼠在平台区象限所游路程与总路程比值。4标本处理：每组取3只大鼠行多聚甲醛灌注进行内固定,取大鼠脑组织进行外固定,石蜡包埋,做HE、硫堇尼氏体染色。刚果红染色确认Aβ注射部位,每组取2只大鼠脑组织做电镜标本。5统计学处理：采用SPSS 11.5统计软件进行分析。结果：1大鼠水迷宫实验结果：对照组大鼠第3,4,5,6天寻找平台的潜伏期分别为24.65,18.02,14.24,10.32秒,模型组大鼠4天的潜伏期明显比对照组长。SSTF中、高剂量组及VE组较模型组明显缩短。对照组大鼠2分钟内穿越平台次数为15.5次、在平台象限停留时间为60.22秒、平台象限路程与总路程比值为62.31%,模型组(6.25,29.25,32.30%)较对照组明显减少；SSTF中、高剂量组及VE组与模型组相比明显增加。2光镜下HE染色显示对照组大鼠海马CA1区神经元有3-4层,核染色深,细胞形态清晰、完整,可见神经元的突起；模型组大鼠海马CA1区有大段神经元缺失,核染色浅,突起消失,大鼠海马CA1区细胞数(56.13)较对照组(142.63)明显减少；SSTF中、高剂量组及VE组较模型组损伤减轻,细胞数较模型组明显增多。大鼠海马尼氏体染色结果与HE染色结果相似。大鼠皮层尼氏体染色显示对照组大鼠皮层细胞较多,神经元形态清晰、完整,核仁清晰,尼氏体染色深、多,突起明显,模型组大鼠皮层局部区域神经元死亡,见断裂的突起和不完整的胞体,细胞数(108)明显少于对照组(543.38)；SSTF中、高剂量组及VE组较模型组损伤减轻,细胞数较模型组明显增多。3超微病理显示对照组大鼠海马神经元核膜清晰、连续,常染色质丰富,核仁大、核质均匀,细胞器丰富、结构正常；模型组大鼠海马神经元胞膜不规则,断续,核膜模糊不清,细胞器明显减少,部分切片可见凋亡细胞；SSTF中、高剂量组大鼠海马神经元超微结构损伤较模型组减轻。电镜下对照组大鼠皮层神经元细胞器形态、结构正常；模型组大鼠皮层神经元局部胞质溶解,核膜局部凹陷,不清晰,细胞器明显减少；SSTF中、高剂量组皮层神经元损伤较模型组减轻。结论：双侧海马注射Aβ引起海马CA1区及皮层神经元严重损伤,导致学习、记忆能力下降,SSTF中、高剂量及VE组能明显改善大鼠海马、皮层神经元结构,提高大鼠学习记忆能力,对注射Aβ引起的损伤有一定保护作用,且SSTF的保护作用具有剂量依赖性。第二部分SSTF对抗Aβ致大鼠学习记忆损伤的抗氧化、抗炎机制研究目的：分析SSTF对抗Aβ致大鼠学习记忆损伤与氧化应激、炎症反应的关系。方法：1血清制备、血清、组织中生化指标检测：大鼠经心脏取血,低温离心,检测血清中SOD、GSH-Px、CAT活力及MDA含量,取11只大鼠新鲜的海马、皮层组织,检测组织中SOD、GSH-Px活力及MDA含量。2大鼠血清TNF-αIL-1β测定,大鼠海马组织中GFAP表达。结果：1大鼠血清SOD、GSH-Px、CAT活力及MDA含量对照组大鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT分别为99.70,1878.86,13.76,模型组(80.88,1613.27,8.34)明显低于对照组；SSTF中、高剂量组与模型组相比明显升高。对照组大鼠血清中MDA为6.40nmol/ml,模型组(12.38)明显高于对照组；SSTF中、高剂量组及VE组较模型组明显降低,且SSTF低、中、高剂量组间存在明显差异。2大鼠海马组织中SOD、GSH-Px活力及MDA含量对照组大鼠海马组织中SOD、GSH-Px分别为100.24,170.74,模型组(72.87,135.16)明显低于对照组；SSTF中、高剂量组及VE组SOD明显高于模型组,SSTF高剂量组GSH-Px明显高于模型组。对照组大鼠海马组织中MDA为4.96,模型组(8.39)明显高于对照组；SSTF中、高剂量组及VE组(6.31,5.30,6.35)明显低于模型组。3大鼠皮层组织中SOD、GSH-Px活力及MDA含量：对照组大鼠皮层组织中SOD、GSH-Px分别为103.35,88.09,模型组(69.99,68.77)较对照组明显降低；SSTF中、高剂量组及VE组SOD明显高于模型组,SSTF高剂量组GSH-Px明显高于模型组。对照组大鼠皮层组织中MDA为5.53,模型组(10.06)明显高于对照组；SSTF中、高剂量组及VE组(8.05,6.23,8.01)明显低于模型组。4模型组大鼠海马胶质细胞数量比对照组明显增多,SSTF中、高剂量组与模型组无明显差别。模型组大鼠血清中TNF-αIL-1β比对照组升高，SSTF中、高剂量组及VE组与模型组比较无明显差别。结论：1大鼠海马注射Aβ可明显降低血清中SOD、GSH-Px、CAT酶的活力,降低大鼠海马、皮层组织中SOD、GSH-Px酶的活力,导致血清、海马及皮层中抗氧化能力降低,氧化产物增多,引起大鼠海马及皮层神经元损伤。SSTF可明显减轻Aβ引起的大鼠血清、海马及皮层中抗氧化酶活力降低,减少氧化产物合成,减轻神经元损伤,具有神经元保护作用,且有一定的剂量依赖性。2大鼠海马注射Aβ可引起大鼠血清中TNF-a,IL-1β合成增多,SSTF对TNF-a, IL-1β合成无明显影响。第三部分SSTF对抗Aβ致大鼠学习记忆损伤的抗凋亡机制研究目的：分析SSTF对抗Aβ致大鼠学习记忆损伤作用与神经元凋亡的关系。方法：1TUNEL法检测细胞凋亡。2免疫组化法检测大鼠海马、皮层组织中bax、bcl-2、caspase-3、cyt-c表达,测定切片着色细胞的光密度值。3 western blotting检测大鼠海马组织中bax、bcl-2、caspase-3、cyt-c表达,测定各指标与β-actin的灰度比值。结果：1 TUNEL检测大鼠海马CA1区及皮层神经元凋亡：TUNEL检测显示,大鼠海马CA1区及皮层凋亡的神经元细胞核着棕黄色,模型组大鼠海马CA1区及皮层着色细胞数比对照组多,着色深,SSTF中、高剂量组较模型组着色细胞数少,着色浅。对照组大鼠海马CA1区及皮层IOD分别为7.77,1.34,模型组IOD(40.41,27.73)明显高于对照组；SSTF中、高剂量组较模型组明显降低,SSTF中、高剂量组间有明显差别。2免疫组化结果：2.1 bax在大鼠海马及皮层神经元胞浆中呈棕黄色颗粒,模型组大鼠海马CA1区及皮层中着色细胞数较对照组多,着色深,SSTF中、高剂量组着色细胞数较模型组少,着色浅。大鼠海马及皮层组织中Bax免疫组化IOD：对照组大鼠海马CA1区及皮层IOD分别为20.78,13.43,模型组IOD(144.51,57.83)明显高于对照组；SSTF中、高剂量组明显低于模型组；且中、高剂量组间有明显差别。2.2 Bcl-2在大鼠海马及皮层神经元胞浆中呈棕黄色,模型组海马CA1区、皮层组织中着色细胞数比对照组少,着色浅,SSTF中、高剂量组较模型组着色细胞多,着色深。大鼠海马CA1区及皮层组织中Bcl-2免疫组化IOD：对照组大鼠海马CA1区及皮层IOD分别为115.24,31.56,模型组IOD(21.45,2.67)明显低于对照组；SSTF中、高剂量组的IOD明显高于模型组。2.3 Caspase-3在大鼠海马、皮层神经元胞浆、胞核中均有表达,模型组大鼠海马CA1区及皮层组织着色细胞数比对照组多,着色深,SSTF中、高剂量组较模型组着色细胞少,着色浅。大鼠海马CA1区及皮层组织中Caspase-3免疫组化IOD：对照组大鼠海马CA1及皮层IOD分别为22.47,3.27,模型组IOD(126.28,18.45)明显高于对照组；SSTF中、高剂量组IOD明显低于模型组。2.4 cyt-c多在大鼠海马及皮层神经元胞浆中表达,呈棕黄色,偶尔也在胞核表达,模型组大鼠海马CA1区及皮层着色细胞较对照组多,着色深,SSTF中、高剂量组较模型组着色细胞少,着色浅。大鼠海马CA1区及皮层组织中cyt-c免疫组化IOD：对照组大鼠海马CA1区及皮层中IOD分别为25.13,2.86,模型组IOD(124.79,16.57)明显高于对照组；SSTF中、高剂量组较模型组明显降低。3 western blotting:对照组大鼠海马组织中bax/β-acti、caspase-3/β-actin、cyt-c/β-actin分别为0.1027,0.0388,0.6053,模型组(0.2678,0.1660,1.2491)明显高于对照组；SSTF中、高剂量组明显低于模型组。对照组大鼠海马组织中bcl-2/β-actin为0.4131,模型组(0.2354)明显低于对照组；SSTF高剂量组(0.2964)明显高于模型组。结论：大鼠海马注射Aβ使促凋亡基因bax、caspase-3、cyt-c表达上调,bcl-2表达下调,引起海马、皮层组织中神经元凋亡,SSTF能下调促凋亡基因bax、caspase-3、cyt-c表达,上调bcl-2表达,减轻Aβ引起的的神经元凋亡。结论：1大鼠海马注射Aβ引起大鼠学习、记忆能力下降与Aβ引起抗氧化酶活力降低,氧化产物合成增多,引起神经元损伤有关；其次与Aβ引起促炎症因子TNF-a, IL-1β释放,导致其它炎症因子释放有关；氧化产物的增多、炎症因子的释放可刺激促凋亡基因bax、caspase-3、cyt-c表达,抑制抗凋亡基因bcl-2表达,进一步加重神经元损伤。2黄芩茎叶总黄酮能减轻Aβ引起的大鼠学习、记忆能力下降,且具有剂量依赖性,其机制可能是通过提高抗氧化酶活性,减少氧化产物合成,上调抗凋亡基因表达,下调促凋亡基因表达,减轻神经元损伤,改善大鼠学习、记忆能力。