山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)是我国重要的野生果树资源。花色苷是山葡萄果实中主要的多酚类次生代谢产物,与山葡萄的抗病性、色泽、风味等密切相关。花色苷不仅影响植物源食品的感官和营养价值,还具有多种医药方面的生理活性。本文进行了山葡萄转色期果皮cDNA文库的构建,对山葡萄花色苷生物合成相关结构基因进行了克隆和序列分析,对山葡萄果实不同成熟期,不同组织与器官中花色苷合成的相关基因表达进行了初步研究。主要研究结果如下：通过三种提取方法提取山葡萄果皮和叶片中的总RNA,其中改良CTAB法能分离出高质量的RNA,可用于下一步的分子生物学研究。以转色期(50%着色)山葡萄果皮为材料,提取总RNA合成cDNA,连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到DH5a中,成功构建了山葡萄果皮cDNA文库。文库质量鉴定表明,原始文库滴度为1.12×106 pfu·mL-1,扩增后的文库滴度为2.82×109 pfu·mL-1,重组率接近100%,插入片段大小范围在0.5-2 kb之间,平均约为0.80 kb,表明应用SMARTTM技术已成功构建了山葡萄转色期果皮cDNA文库。山葡萄转色期果皮cDNA文库测序获得974条有效EST序列。GenBank登录号：GW666520-GW667493。974条EST拼接后代表了710个UnigeneS。BLAST注释结果表明,具有已知或推测功能基因270个,未知功能基因258个,未比对上的基因182个(可能是新基因)。根据BLASTX注释与GO分类,199条EST序列具有细胞组件功能,313条EST序列在分子功能上得到注释,341条EST序列在生物学途径上得到注释。采用RT-PCR、SMARTTM RACE技术从山葡萄成熟期果皮中克隆到了类黄酮-3’-羟化酶(VAmF3’H)、类黄酮-3’,5’-羟化酶(VAmF3’5’H)、黄烷酮醇4-还原酶(VAmDFR)、无色花色素双加氧酶(VAmLDOX)、类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶(VAm3GT)、O-甲基转移酶(VAmOMT)、谷胱甘肽转移酶(VAmGST4)和类黄酮5-O-葡萄糖基转移酶(VAmOGT)等8个基因的cDNA全长序列。GenBank登录号为：FJ645766、FJ645767、FJ645768、FJ645769、FJ169463、GU237132、FJ645770和GU237133。利用生物信息学分析,推测8个基因分别编码509、508、337、355、456、235、213和448个氨基酸的多肽,分子量为56.14、56.70、37.50、40.19、50.19、26.35、24.24和49.84 kDa。与其它物种相关基因的氨基酸序列进行了多重比较,各基因与欧亚种葡萄(Vitis vinifera L.)相关基因的相似性均超过90%。在此基础上构建了这8个基因与其它物种相应基因的分子进化树,分析了与其它物种相关基因的亲缘关系。各基因信号肽预测结果表明,8个基因都不具有信号肽结构,对各基因分别进行了疏水性分析,初步预测了其二级结构。对山葡萄幼叶、成熟叶、茎、果肉和果皮中花色苷生物合成结构基因的表达进行了初步研究。半定量RT-PCR分析结果表明,VAmF3’H和VAmF3’5’H在花后各个时期的果皮中均有表达,转色期上调表达；VAmDFR、VAmLDOX和VAmOGT在花后各个时期的果皮中均有表达,各个时期的表达强度差异不明显；VAm3GT和VAmGST4在果实转色期前基本不表达,转色期为上调表达；VAmOMT在花后两周有少量表达,随后表达量下降,转色期开始上调表达。VAmF3’H、VAmF3’5’H、VAmDFR、VAmLDOX和VAmOGT在各个组织与器官中均有表达,但VAmF3’5’H在成熟叶中的表达量很少；VAm3GT、VAmOMT和VAmGST4在叶片中都不表达,在茎、果肉、果皮中都有表达,VAmOMT在果肉中表达丰度低。Northern杂交结果表明,VAm3GT在果实转色期前基本不表达,转色期上调表达;VAmOGT在果实成熟过程中均有表达。用DNA重组技术构建了PQE30-Xa-VAm3GT和PQE30-Xa-VAmOGT原核表达载体,转入大肠杆菌M15表达6×His融合蛋白。结果表明,重组蛋白进行了大量表达,通过Ni-Sepharose FF纯化后,两种蛋白的分子量为50 kDa和49.5 kDa左右,重组蛋白的酶学功能和特性正在进行研究。