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本文以甘草为研究材料,运用传统的分离培养方法并结合非培养方法PCR-DGGE技术,对采自内蒙古鄂尔多斯地区的野生及栽培甘草的不同部位内生细菌的多样性进行了研究,比较了野生及栽培甘草不同部位内生细菌群落的多样性差异,并获得了一批内生细菌菌株资源。
对野生及栽培甘草根、茎、叶组织中的内生细菌进行分离和计数,发现野生及栽培甘草根、茎、叶部位的内生细菌菌落数分布在3.10×102~1.37×106(单位:cfu/g鲜重)上,总体来说,野生甘草内生细菌菌落数大于栽培甘草,内生细菌在甘草根、茎、叶部位的菌落数和种群数量均有差异,野生及栽培甘草均表现出根和叶部的内生细菌种类比茎部丰富。应用分子方法ERIC-PCR方法对分离内生细菌进行菌株水平的多样性检测,共得到内生细菌121株。对其中82株进行16SrDNA片段测序分析,结果表明这些内生细菌分别与Genbank中α、β、γ-Proteobacteria,Firmicutes、Actinobacteria五类细菌中的19个已知属相似性达到97-100%。其中γ-Proteobacteria和Firmicutes最多,分别占45.78%和42.17%,剩余的12.05%为其余三类。内生细菌的主要优势种群为芽孢杆菌属(Bacillussp.)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、泛菌属(Pantoeasp.)和沙雷氏菌属(Serratiasp.)。
对同一批甘草样品进表面灭菌后,以CTAB法提取植物基因组DNA,用引物799f-1492r扩增细菌16SrDNA片段,应用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对内生细菌菌群多样行进行分析。DGGE指纹图谱显示野生及栽培甘草不同生长部位的优势内生细菌较为相似,个别部位有其特有的优势菌。对其中的1-9号亮度较高的条带回收并克隆测序,显示他们与Genbank中γ-Proteobacteria类细菌中的Enterobactersp.、Pantoeasp.、Klebsiellaoxytoca、Serratiasp.相似性达到97%-100%。
采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法对可培养内生细菌及非培养内生细进行比对分析,结果显示可培养细菌的DGGE条带未能与基因组内生细菌中的条带产生很好的对应,可培养内生细菌样品条带分布在凝胶中较高浓度梯度区域,而非培养内生细菌条带的范围则分布在较低浓度梯度区域。在野生和栽培的根、茎、叶六组样品中,仅有栽培茎(CS)中的分离菌株CS1b可以与其非培养内生细菌中的的9号条带(Pantoeaagglomerans)很好的对应。
对可培养内生细菌进行16SrDNA片段测序后,发现在Genbank中与菌株WS10b相匹配的菌株多为非培养细菌。应用生理生化、APi20E、Biolog细菌鉴定系统、16SrDNA全序列测定等多种方法对其进一步鉴定,初步确定其属于肠杆菌科的泛菌属,对其是否是新种的确定还需进一步研究。