苯丙酮尿症(Phenylketonuria,PKU,MIM#261600)是新生儿最常见的氨基酸代谢障碍性疾病,属于常染色体隐性遗传,主要由于苯丙氨酸羟化酶基因(phenylalanine hydroxylase gene,PAH,612349)突变导致苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)活性下降或缺乏,导致血中苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)浓度增高并在神经系统和血液中蓄积。未经治疗的PKU主要表现为智力低下,癫痫抽搐等不可逆的神经系统损伤。高苯丙氨酸血症(Hyperphenylalaninemia,HPA)是一种遗传异质性疾病,包括苯丙氨酸羟化酶缺乏症和其辅酶四氢生物蝶呤(tetrahydro biopterin,BH4)缺乏症(tetrahydro biopterin deficiency,BH4D),二者的病因及治疗方式完全不同,因此准确诊断PKU对患儿具有重要意义。PAH基因定位于染色体12q22~q24.1区域,由13个外显子组成,编码区全长90kb,编码含有452个氨基酸的单体蛋白。以Sanger测序为基础的基因诊断是疾病诊断和鉴别诊断的金标准,在PKU患儿的筛查、诊断以及家系的产前诊断中具有重要意义。PAH基因突变分布特点具有明显的地域、种族遗传异质性。研究不同地域、种族的PAH基因突变谱为该地区、民族建立快速高效的PKU基因诊断、遗传咨询、产前诊断体系提供重要依据。PKU为可治性遗传病,低苯丙氨酸饮食是目前主要的治疗方法,早期治疗可使90%以上患儿达到正常智力发育水平。但是治疗费用昂贵和疗效的不稳定以及治疗依从性差等使一些患儿仍受到疾病影响,产前诊断是预防PKU患儿出生的主要手段。由于pah基因只在肝脏中表达,因此不能通过检测羊水中pah酶活性进行产前诊断,只能通过dna序列分析的方法对胎儿进行基因型检测,间接推断胎儿表型。中国pku患者pah基因突变具有热点突变且60%以上为点突变,荧光pcr熔解曲线技术可快速有效地检测基因突变。为建立荧光pcr快速诊断pku技术平台,首先必须了解中国pku患者pah基因突变的特征,筛选出pah基因的高频突变热点,依据突变热点设计探针获得更高的诊断率。我们针对中国人群pah基因的突变特点,利用实时荧光定量pcr平台,将荧光pcr熔解曲线技术应用于pku基因诊断,建立的检测体系具有快速、高效、高通量、低成本等优点,在pku的基因诊断和群体筛查中具有重要的应用价值。材料与方法1苯丙酮尿症家系收集2008年1月~2014年6月来自郑州大学第一附属医院遗传咨询门诊、郑州大学第三附属医院新生儿筛查中心、郑州市妇幼保健院新生儿筛查中心的655个无亲缘关系的中国北方汉族pku家系为研究对象。所有患儿均通过bh4负荷试验和尿蝶呤分析并结合临床症状排除了四氢生物喋呤缺乏症。对pah基因诊断明确的112个家系中118个胎儿(5个家系进行了两次产前诊断,1个家系中为双胎妊娠)进行产前诊断。2pah基因sanger测序设计pah基因13个外显子、外显子和内含子交界区、部分启动子区域共13对引物进行pcr扩增,pcr产物直接进行双向sanger测序,寻找基因突变位点。所有序列变异位点均针对该位点检测患者父母的dna序列。3mlpa分析经sanger测序后未检测到或仅检测到1个突变等位基因的患者,采用多重连接依赖式探针扩增(multiplesligation-dependentprobeamplification,mlpa)进行pah基因拷贝数变异的分析。4荧光pcr熔解曲线采用荧光pcr熔解曲线技术对常见的27种pah基因突变进行检测。5str分析选择pah基因3个str位点pah-str、pah-26、pah-32,上游引物5’端均采用荧光素fam进行标记。pcr扩增后取pcr产物5μl变性后直接上机进行毛细管电泳片段分析。6突变命名和验证新序列变异通过检索pubmed,thehumangenemutationdatabase(hgmd?)来初步确定为新发现的序列变异,并查询千人数据库、dbsnp数据库及hapmap数据库进一步排除是snp。新突变的命名参照国际基因变异命名体制http://www.hgvs.org/mutnomen提供的命名法来命名。7新序列变异的生物信息学分析采用clustalw分析软件对人类和其他种属的pah氨基酸序列进行了同源序列比较,并对错义突变的功能进行proveanprediction和polymorphismphenotyping(polyphen-2)分析。8胎儿产前诊断对112个家系中的118个胎儿采用pah基因突变分析联合str方法进行诊断,并同时进行家系亲缘关系鉴定以保证连锁分析的准确性。9胎儿随访对患胎流产组织进行pah基因突变分析验证,继续妊娠胎儿出生后采集足跟血采用guthrie细菌抑制法进行新生儿pku筛查。结果1pah基因突变在患者中的分布在655个pku家系的1310个pah等位基因中共检测到1266个突变等位基因,检出率为96.64%。613例患者携带双等位基因突变,40例患者携带单等位基因杂合突变,2例患者未检测到等位基因突变;534例患者携带复合杂合突变,63例患者携带纯合突变,40例患者携带单杂合突变,16例患者携带3个突变,2例患者未检测到突变;对已收集的父母标本进行相应突变位点检测,在2个家系中发现先证者携带新生突变,亲缘关系鉴定证实为亲生,其余家系中所有突变位点均来自双亲。2pah基因突变类型和特点655个pku家系中共发现175种pah基因突变,突变涉及7种类型,包括错义突变107种(61.1%)、剪切区突变34种(19.4%)、无义突变15种(8.6%)、小片段缺失11种(6.3%)、大片段缺失6种(3.4%)、插入突变1种(0.57%)、插入缺失突变1种(0.57%)。1266个被检出等位基因中以p.r243q(17.70%)突变发生频率最高、其它依次为ex6-96a>g(8.27%)、p.v399v(6.40%)、p.r53h(4.68%)、p.y356x(4.68%)、p.r241c(4.60%)、p.r413p(4.60%)、p.r111x(4.37%)、c.442-1g>a(3.43%),此9种突变占所有突变等位基因的58.73%。175种突变分布于pah基因的1-13外显子及其侧翼内含子区域,等位基因外显子发生频率最高的是第7外显子33.33%(423/1269),其次是第11外显子14.42%(183/1269)、6外显子13.08%(166/1269)、12外显子10.87%(138/1269)、3外显子10.55%(134/1269)、5外显子4.41%(56/1269)。3mlpa分析采用mlpa方法对仅检测到1个或未检测到突变等位基因的53例pku患者进行pah基因大片段缺失/重复分析,13例患者携带pah基因大片段缺失。4荧光pcr熔解曲线分析采用熔解曲线法针对苯丙酮尿症试剂盒中pah基因27种突变的检出率和准确率分别为85.6%和98.7%。5pah基因新突变序列变异的生物信息学分析结果本研究共发现39种pah基因新突变,将人类、黑猩猩等不同物种的pah蛋白氨基酸序列进行比对分析,所发现pah基因新序列变异位点在各个物种间高度保守。结合proveanprediction和polyphen-2和物种间保守性分析结果显示所有新序列变异为有害突变可能性大。6胎儿产前诊断结果107个家系中的胎儿采用pah基因突变分析和str连锁分析方法进行产前诊断,5个家系因先证者已故无法进行str连锁分析,仅采用pah基因突变分析方法诊断。经pah基因测序分析118例胎儿中112例获得明确诊断(94.9%),联合3个str位点,94个家系(79.7%)能提供100%信息;19个家系(16.1%)只能提供50%的排除性诊断信息,5个家系(4.2%)不能提供诊断信息。118个进行产前诊断家系胎儿中,31个胎儿携带与先证者相同的pah基因复合杂合突变;58个胎儿携带pah基因单杂合突变,为携带者;29个胎儿未携带pah基因突变,为正常个体可能性大。7胎儿遗传咨询及随访31个胎儿携带与先证者相同的pah基因突变,告知家属胎儿出生后为与先证者相同的pku患儿的可能性大,30个患胎家属选择终止妊娠,胎儿流产物基因分析结果与产前诊断结果一致,另1例患胎父母选择继续妊娠,胎儿出生后phe值为1650μmol/l(27.5mg/dl),为pku患者;87个携带者和正常胎儿继续妊娠,64个胎儿已出生,出生后新生儿pku筛查结果正常(<120μmol/l),余23个胎儿妊娠中。结论1.中国北方汉人群pah基因突变构成有别与其它种族人群,构建中国北方pku患者pah基因突变数据库为基因诊断和产前诊断及群体筛查奠定基础。2.pah基因突变分析联合连锁分析的基因诊断方法可为pku家系提供快速、准确的产前诊断。3.39种pah基因新突变的发现进一步丰富了人类pah基因突变数据库。4.荧光pcr熔解曲线法是一种快速、准确、经济的pah基因诊断方法。