伊枯草菌素A是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵产生的一种脂肽类抗生素，具有很强的抗真菌活性和较广泛的抗菌谱，有潜力开发成为一种高效低毒的生物农药。前期，本实验室对伊枯草菌素A高产菌株ZK8进行了初步的发酵工艺研究，但其工艺和产量还有待进一步提高。　　本实验研究工作提出了一种更为有效的发酵条件优化方法，并用摇瓶补料分批发酵进行了验证;较全面的研究了5L发酵罐补料分批发酵工艺下菌体生长、代谢规律，并建立更优化完善的发酵工艺，使伊枯草菌素A产量得到明显提高;在此基础上，对5L发酵罐中发酵动力学进行了分析，并在50L发酵罐上实现了工艺放大。　　本研究具体内容包括以下四章:　　第一章:用神经网络方法优化伊枯草菌素A的摇瓶补料分批发酵条件　　采用基于均匀设计的人工神经网络（ANN）对伊枯草菌素A摇瓶发酵过程中的氨基酸补料-分批发酵条件进行优化，并同均匀设计(UD)方法进行比较。　　人工神经网络基于均匀设计，能得到精确的模型，通过人工神经网络-遗传算法（ANN-GA）的优化，伊枯草菌素A摇瓶发酵产量达到了13364.5±271.3U/mL，相比对照提高了34.6％。人工神经网络模型相对于训练集和测试集的均方根误差分别为4.48和273.58（均匀设计模型为32.21和483.12）;ANN模型相对于训练集和测试集的相关系数分别为100％和92.62％(UD模型为99.86％和78.58％); ANN模型相对于训练集和测试集的误差百分数分别为0.093和2.19(UD模型为0.26和4.15)ANN-GA模型和UD模型对最优值的预测误差分别为0.8％和2.17％。本研究结果表明，神经网络应用于发酵条件的优化，在拟合性、预测能力、泛化能力上，均优于均匀设计。在模型敏感性分析上，神经网络同样能像统计学方法一样得到对响应值的因素作用显著性分析。因此，神经网络有希望作为一种更好的均匀设计等统计学方法的替代方法，应用于发酵条件的优化。　　第二章:5L发酵罐三种补料模式的发酵工艺研究　　进行了三种补料模式分批发酵工艺研究。　　1.进行了“氨基酸”补料模式分批发酵工艺研究。通过分析5L罐分批发酵中氨基酸变化规律，确定氨基酸补料时间为发酵开始第3h到10h。用3因素8水平均匀设计对5L发酵罐发酵过程中氨基酸补料条件进行了优化。根据均匀设计原理，采用伊枯草菌素A产量作为响应值，天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)和脯氨酸(Pro)三种氨基酸在3-10h发酵液中的维持浓度为自变量，对照均匀设计表U8*(85)，设计3因素8水平实验。实验结果用MINITAB进行统计学分析。结果表明，Asp、Glu、Pro维持浓度分别为90mg/L、60mg/L、36mg/L时，最高效价达到17018U/mL，较分批发酵提高了90.2％。　　比较了三个不同浓度(Asp-Glu-Pro的浓度分别为50-30-20、90-60-36、150-90-60mg/L)的氨基酸补料分批发酵，结果表明氨基酸的流加促进了碳源的消耗，减少了氮源的消耗，从而指导在氨基酸和碳、氮源混合补料时应增加碳源流加而减少氮源流加。　　2.进行了“碳源+氮源”补料模式分批发酵工艺研究。碳源和氮源的补料时间均为发酵开始第10h到15h。结果表明，此发酵模式下，菌体浓度达到4.42×1010cell/mL，效价达到11748U/mL,相比分批发酵分别提高了136.4％和31.3％。　　3.在以上基础上，进行了5L罐“氨基酸+碳源+氮源”补料模式分批发酵研究。其发酵工艺为:在发酵3h-9h流加三种氨基酸(Asp、Glu、Pro)，使得Asp、 Glu和Pro的维持浓度分别为90mg/L、60mg/L、36mg/L，在发酵9h-15h流加碳源，在发酵10h-15h流加氮源。此工艺下，生物量达到4.26×1010cell/mL，较分批发酵、“氨基酸”补料模式和“碳源+氮源”补料模式分别提高了127.8％、103.8％和-3.6％;效价达到38429.8±300.4U/mL，较分批发酵、“氨基酸”补料模式和“碳源+氮源”补料模式分别提高了302.3％、125.8％和227.1％。伊枯草菌素A含量达到2.03±0.0028g/L，较分批发酵、“氨基酸”补料模式和“碳源+氮源”补料模式分别提高了278.6％、112.8％和208.0％。伊枯草菌素A产量在原有基础上得到了明显提高。　　研究结果表明，三种工艺中，以“氨基酸+碳源+氮源”补料模式分批发酵产量最高，工艺最优化。　　第三章5L发酵罐中枯草芽孢杆菌产生伊枯草菌素A的发酵动力学研究　　通过采用分段拟合的方式，选用不同的数学模型（包括Sigmoid模型的Boltzmann函数、线性函数、Sigmoid模型的DoseResp函数、Sigmoid模型的DoubleBoltzman函数、Sigmoid模型的Slogistic函数、Sigmoid模型的DoubleDoseResp函数、Polynomial模型的Cubic函数、Peak Function模型的Guss函数和Polynomial模型的Ploy5函数），对5L发酵罐中伊枯草菌素A“氨基酸+碳源+氮源”补料模式分批发酵进行了动力学拟合和分析，建立了在此工艺下，发酵过程中细胞生长、还原糖消耗、总氮消耗、伊枯草菌素A合成和三种氨基酸(Asp、Glu、Pro)消耗的动力学模型。对模型的方差分析表明，以上模型的P值均小于0.05，表明以上模型均非常显著，由模型计算所得的发酵任意时刻的参数均高度可信，通过拟合曲线能很好的对发酵过程进行描述。根据拟合方程，分别计算出细胞生长、还原糖消耗、总氮消耗、伊枯草菌素A合成和三种氨基酸(Asp、Glu、Pro)消耗在发酵过程中的比速率，得到比速率曲线。对比速率曲线的分析表明，氨基酸和碳、氮补料分别促进了细胞对对应氨基酸、还原糖和总氮的消耗，各种底物和细胞生长、伊枯草菌素A合成间为复杂的部分偶联关系。根据拟合方程计算出发酵过程中，分别对还原糖、总氮和三种氨基酸(Asp、Glu、Pro)的细胞和伊枯草菌素A得率，绘制出得率曲线。对不同底物的细胞和伊枯草菌素A得率曲线分析结果表明，在补料期间，氨基酸和碳氮源均对细胞和伊枯草菌素A增长有较大影响，而总氮对细胞和伊枯草菌素A的影响则最为重要。通过动力学研究，为发酵工艺放大和控制提供了理论依据，对推动伊枯草菌素A发酵工艺的进一步发展具有重要意义。　　第四章50L发酵罐放大实验及过程相关参数分析　　在5L发酵罐基础上，对“氨基酸+碳源+氮源”补料模式分批发酵工艺进行了50L罐的放大和调整，补料工艺为:在发酵3h-9h维持Asp、Glu、Pro浓度为90mg/L、50mg/L、40mg/L，在9h-15h内流加碳源补料液，在10h-15h内流加氮源补料液，伊枯草菌素A在50L发酵罐中连续三批的平均效价达到35076.5±304.2U/mL,含量达到1.83±0.22g/L，达到了预期目标。　　在此基础上，分析了50L发酵罐中温度(T)、pH值、搅拌转速(rpm)、通气量、溶氧(DO)、尾气中O2含量、尾气中CO2含量、呼吸商(RQ)、摄氧率(OUR)、二氧化碳排放率(CER)、氧传递系数(KLa)等10个在线参数和菌体浓度、还原糖浓度、总氮浓度、伊枯草菌素A生物活性和含量、氨基酸浓度等5个离线参数间的关系。结果表明，细胞生长代谢和这些参数均有直接和间接的关系。随着菌体浓度变化，转速、尾气中CO2含量、OUR、CER均同步变化，尾气中O2含量则与之变化相反，它们与菌体生长直接相关;KLa变化和转速变化相关，一定程度上反映了菌体的生长规律;pH值和RQ的变化与细胞生长、伊枯草菌素A产量、还原糖浓度变化、总氮浓度变化和氨基酸浓度变化有对应关系，表明这些参数的同步变化能够反映出发酵过程中细胞代谢的改变。其中菌体生长与尾气中CO2含量、OUR、CER呈正相关性，而与尾气中O2含量呈负相关性。这些参数间的关系以及和菌体生长代谢的关系可作为理论依据指导该工艺的发酵过程。