结直肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，发生率高居全球恶性肿瘤第四位。近年来，因生活模式的西化，我国结直肠癌的发病率和死亡率有逐年增高的趋势，发病年龄也明显提前。手术和化疗是结直肠癌的主要治疗手段，但由于患者确诊时多属中晚期，单纯手术的效果未能令人满意。传统的化疗药物主要靠细胞毒性杀伤癌细胞起作用，同时会伴随选择性差、毒副作用大等缺点。诱导分化和凋亡是近年肿瘤化疗的新思路：诱导肿瘤细胞向正常细胞分化，而不能分化的细胞发生调亡，这是最理想的肿瘤防治模式。维甲酸类药物是指维生素A的天然及人工合成的衍生物，是目前最常用的细胞分化诱导剂。大量基础研究和临床试验均显示其可抑制多种实体肿瘤的形成和转移(包括结直肠癌)，但不断深入的基础研究却发现不是所有细胞株均对维甲酸敏感，有些类型的细胞株(如结肠癌HT-29细胞株)对维甲酸有原发的耐药性，临床试验亦未能取得预期的效果，研究者认为是原发肿瘤存在多种异质性细胞亚克隆，耐药细胞的存在是导致维甲酸的临床疗效不如预期的原因。故明确和克服维甲酸的耐药机制，是突破维甲酸治疗的瓶颈、推广维甲酸在临床应用的关键。环氧化酶2(COX-2)是前列腺素合成的限速酶，在结肠腺瘤和结肠癌中高表达，其早已被证实在结直肠癌发生和转移过程中起重要作用，COX-2表达水平还被证实与多种药物的耐药性密切相关。而塞来昔布作为环氧化酶2的特异抑制剂也被证实可增加化疗药物的敏感性。既往在食管癌和肺癌方面的研究发现COX-2和维甲酸作用的关键蛋白维甲酸受体beta(RARβ)成负相关关系，两者可能影响肿瘤对维甲酸的敏感性。塞来昔布是否也可通过抑制COX-2增加维甲酸敏感性有待进一步研究。　　 第一部分塞来昔布对人结肠癌细胞株HT-29和SW480维甲酸敏感性的影响　　 目的：观察人结肠癌细胞株HT-29和SW480对全反式维甲酸的敏感性，验证塞来昔布对HT-29和SW480维甲酸敏感性的影响，筛选药物最佳浓度和作用时间，并初步探讨其作用机理。　　 实验方法：Western blot法检测两种细胞COX-2蛋白表达水平的差异。MTT比色法检测不同浓度全反式维甲酸(ATRA)和塞来昔布(celecoxib)单独或联合作用不同时间对两种肿瘤细胞的增殖抑制率的影响，并观察加入外源性前列腺素E2(PGE2)对ATRA和celecoxib联合用药增殖抑制作用的影响。流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测全反式维甲酸和塞来昔布单独或联合作用对肿瘤细胞凋亡率的影响，并观察加入外源性前列腺素E2(PGE2)对ATRA和celecoxib联合用药促凋亡作用的影响。　　 实验结果：两株细胞的COX-2蛋白表达水平不同，HT-29为高表达COX-2蛋白的细胞株，而SW480低表达COX-2蛋白。联合塞来昔布后维甲酸对两种细胞株的增殖抑制作用都明显增强，而且增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性。ATRA单独作用HT-29细胞72小时的IC50为65.2±21.0μmol/L，联合5μmol/L和10μmol/L的塞来昔布后IC50分别为10.3±1.6μmol/L和1.7±0.9mol/L，p＜0.01。ATRA单独作用SW480细胞72小时的IC50为54.2±16.9μmol/L，联合5μmol/L和10μmol/L的塞来昔布后IC50分别为9.7±1.8μmol/L和1.9±0.8mol/L，p＜0.01。单用维甲酸处理后HT-29的凋亡率很低(2.98±0.48)，同样单用塞来昔布处理后HT-29的凋亡率也很低(2.84±0.69)，但联合塞来昔布和维甲酸处理后HT-29的凋亡率明显增高(11.56±1.47，p＜0.01，n=3)，加入PGE2后并无减弱塞来昔布和全反式维甲酸联合用药的促凋亡作用(11.60±1.29，p＞0.05，n=3)。　　 结论：塞来昔布可增加人结肠癌细胞株HT-29和SW480对维甲酸的敏感性，两者联合用药可增强增殖抑制作用，而且呈时间和浓度依赖性。塞来昔布和全反式维甲酸联合用药可增强促凋亡作用，而且此作用不能被外源性PGE2抑制。塞来昔布增加HT-29细胞维甲酸敏感性的作用可能是通过非COX-2依赖途径实现的。　　 第二部分塞来昔布增加耐药株HT-29细胞对维甲酸敏感性的机制研究　　 目的：探讨塞来昔布增加HT-29细胞株维甲酸敏感性的作用与维甲酸受体beta(RARβ)和COX-2的关系，阐明联合用药的分子机理。　　 实验方法：Elisa法检测NS398和塞来昔布对HT-29细胞分泌前列腺素E2(PGE2)的影响，反映药物对COX-2活性的影响。MTT比色法检测不同浓度全反式维甲酸(ATRA)和NS398单独或联合作用不同时间对两种肿瘤细胞的增殖抑制率的影响。免疫组化和Western blot检测塞来昔布和NS398作用对HT-29细胞维甲酸受体beta(RARβ)表达的影响，并观察加入外源性前列腺素E2(PGE2)对塞来昔布和NS398作用的影响。　　 实验结果：10μM、20μM的NS398分别与5μM、10μM的塞来昔布对HT-29细胞前列腺素E2分泌的抑制作用相仿(p＞0.05)。但MTT结果显示联合20μM的NS398后ATRA在HT-29和SW480细胞的IC50分别为63.9±18.1μmol/l和62.2±17.6μmol/l，与单独使用ATRA组比较，p＞0.05，提示NS398并不能像塞来昔布那样增强全反式维甲酸对HT-29和SW480细胞的增殖抑制作用。RARβ蛋白在细胞核内表达。免疫组化和Western blot均发现对照组与单用ATRA组的RARβ蛋白表达水平相仿(p＞0.05)，但加用塞来昔布后RARβ蛋白水平有明显差别(p＜0.05，n=3)，提示塞来昔布增加HT-29细胞中RARβ蛋白的表达；加入外源性PGE2并不能减弱塞来昔布增加RARβ表达的作用。而NS398并不能增加HT-29细胞中RARβ蛋白的表达。　　 结论：塞来昔布可增加人结肠癌细胞的RARβ蛋白表达水平，而NS398不能增加人结肠癌细胞的RARβ蛋白表达。RARβ蛋白表达水平与人结肠癌细胞株对全反式维甲酸的敏感性密切相关，可能作为预测维甲酸疗效的生物指标。塞来昔布增加人结肠癌细胞的RARβ蛋白表达和维甲酸敏感性的作用是通过非COX-2依赖途径实现的。　　 全文结论　　 1.塞来昔布可增加人结肠癌细胞株HT-29和SW480对维甲酸的敏感性，两者联合用药可增强增殖抑制和促凋亡作用，有望为临床提供可行的联合用药方案。　　 2.塞来昔布可增加人结肠癌细胞的RARβ蛋白表达水平。　　 3.RARβ蛋白表达水平与人结肠癌细胞株对全反式维甲酸的敏感性密切相关，可能作为预测维甲酸疗效的生物指标。　　 4.塞来昔布增加人结肠癌细胞的RARβ蛋白表达和维甲酸敏感性的作为是通过非COX-2依赖途径实现的。