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巴什拜羊主要产于我国新疆塔城地区的裕民县,作为当地的优良品种,具有生长发育速度快、耐寒且抗病力强的特性,尤其对绵羊肺炎支原体表现为抗性。盘羊是体型最大的羊属动物。将父代盘羊与母代巴什拜羊杂交后,其后代羊具备了盘羊体格大的特点以及巴什拜羊羔羊阶段发育速度快的遗传特性,但其易患绵羊肺炎支原体,成活率较低。肺表面活性物质相关蛋白A(Pulmonary surfactant-associated protein A,SP-A)是一种亲水性糖蛋白,作为C-型凝素家族成员中一员,在肺的天然免疫反应以及局部防御中起着非常重要的作用,。目的:本研究分别克隆巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A基因的cDNA全长序列,并与其它品种的羊和动物进行对比研究,并对巴什拜羊及其与盘羊杂交羊的SP-A基因进行真核表达,最后通过研究重组SP-A蛋白(Recombinant pulmonary surfactant-associated protein A,rSP-A)对体外培养的绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)生长的影响来检测其活性,为巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A蛋白的体外功能的研究奠定了基础。方法:(1)巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A基因的全长c DNA序列的克隆:分别采集巴什拜羊及其与盘羊杂交羊肺组织样品,Trizol法分别提取两种羊肺组织总RNA,参考GenBank中绵羊的SP-A基因序列设计特异性引物,然后用RACE法分别对巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A基因的3’端和5’端序列进行克隆,经公司测序后,将获得的序列用DNAMAN软件进行拼接最终获得两种羊SP-A基因的全长cDNA。分别将克隆得到的巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A基因与其它动物进行同源性分析。(2)巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A基因的cDNA序列的生物信息学分析:通过相关文献获取在线生物信息学分析工具的网址以及生物信息学相关软件,然后用这些工具和软件分别对获得的巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A基因cDNA序列进行分析,主要分析内容为SP-A基因的核酸序列、亲/疏水性、SP-A蛋白的信号肽以及编码氨基酸、SP-A蛋白亚细胞定位、蛋白的高级结构以及系统进化树分析。(3)巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A基因真核表达及蛋白纯化:根据RACE法克隆出的两种羊的SP-A基因cDNA序列来设计特异性引物,使用RT-PCR法分别扩增出两种羊的SP-A基因的ORF,将扩增出的ORF片段与pPIC9K载体相连接构建重组表达质粒pPIC9K-SP-A,将重组表达质粒线性化以后用电击转化的方法将其电转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,并利用甲醇对重组菌株GS115/pPIC9K-SP-A进行诱导表达,SDS-PAGE检测rSP-A的表达并用Western Blotting法鉴定目的蛋白rSP-A,最后用镍柱亲和层析法分别对两种羊重组毕赤酵母GS115表达的rSP-A进行纯化。(4)巴什拜羊及其与盘羊杂交羊rSP-A对Mo生长的影响:利用平板菌落计数法检测巴什拜羊及其与盘羊杂交羊rSP-A对体外培养的Mo生长的影响。结果:(1)结果显示克隆的巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A基因cDNA序列大小均为1962bp,开放阅读框序列大小均为747bp,编码248个氨基酸,5’非编码区长111bp,3’非编码区长1104bp,分析核苷酸差异性发现两种羊5’非编码区有1处碱基差异,3’非编码区有3处碱基差异,开放阅读框内有3处碱基差异,并使得2个氨基酸发生了变化。同源性分析结果显示巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A基因核苷酸序列以及编码氨基酸序列均与绵羊同源性最高;(2)DNASTAR软件分析预测巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A基因编码的蛋白分子量大小分别为26.38kDa和26.39kDa,蛋白的等电点分别为4.855和4.942。亲/疏水性分析结果显示两种羊SP-A蛋白均具有高亲水性。二级结构、三级结构分析结果显示,巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A蛋白的二级结构和三级结构以无规则卷曲为主,其次是α-螺旋和β-折叠,两种羊SP-A蛋白均含1个N糖基化位点,5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,5个酰基化位点,和1个c型凝集素结构域特征,利用NCBI的BLAST比对预测巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A的结构域,发现它含有Collagen(胶原蛋白)结构域和CLECT结构域。蛋白信号肽结果分析表明两种羊SP-A蛋白N端均设有17个氨基酸残基的信号肽,亚细胞定位分析结果表明两种羊SP-A蛋白均在细胞外。系统进化树分析结果显示巴什拜羊及其与盘羊杂交羊均与绵羊在进化关系上最近;(3)巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A的真核表达载体经双酶切验证后表明其构建成功,重组毕赤酵母GS115经基因型和表现型验证后表明两种羊的SP-A基因均分别整合到了毕赤酵母GS115当中,在毕赤酵母成功表达的蛋白分子量分别为巴什拜羊的26.38kDa和盘羊杂交羊的26.39kDa;(4)平板菌落计数结果显示,当巴什拜羊及其与盘羊杂交羊r SP-A浓度大于20μg/mL时,能够显著(p<0.05)抑制Mo在琼脂平板上的生长,说明表达的蛋白是具有生物活性的蛋白。结论:本研究成功克隆了巴什拜羊及其与盘羊杂交羊SP-A基因的cDNA全长序列,并对该基因进行了真核表达,蛋白纯化以及蛋白的活性检测,为后续研究两种羊SP-A基因以及SP-A蛋白的结构和功能奠定了基础。