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宫颈癌是全球排名第四的女性恶性肿瘤,2018年全球新发宫颈癌病例约57万,死亡病例约31万,我国是宫颈癌的高发地区,每年新发病例超过13万,宫颈癌严重威胁着中国妇女的身体健康,并造成沉重的社会负担和经济负担。人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)的持续感染是宫颈癌发生的必要因素,持续性的高危型HPV感染会导致高级别的宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelialneoplasia,CIN),进而发展成癌。宫颈癌的发生和发展是一个缓慢的过程,通常需要持续10-30年的时间,这给宫颈癌的筛查和防治提供了绝佳的时间窗口。通过筛查早期宫颈癌前病变,其治愈率为100%。目前最主要的筛查手段是液基细胞学检测(TCT)和HPV检测,但细胞学检测灵敏度低仅60%左右,而HPV检测特异性差,细胞学检测40-60%的ASCUS患者检测HPV阳性,只有不到1%的患者会确诊为癌症,两种方法的不足造成的漏诊和过诊问题一直困扰着临床,迫切需要新的检测方法精准识别出高级别病变,用于宫颈癌的筛查。DNA甲基化是DNA的一种表观修饰,通过甲基化转移酶将甲基基团加入到胞嘧啶的5’碳上的过程。DNA的甲基化在很多疾病的发生发展中发挥着重要作用,异常的甲基化和宫颈癌的进展直接相关,甲基化是临床最具潜力的诊断和治疗标志物,但目前研究报道的宫颈癌相关甲基化位点都不能满足临床需求。本研究通过对癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)宫颈癌的甲基化数据和基因表达数据进行生物信息分析和挖掘,设置90%宫颈癌组织甲基化BetaValue>0.4,正常组织甲基化BetaValue<0.2做数据初筛,然后挑选宫颈癌组织和正常组织中差异大的位点,寻找在宫颈癌组织和正常组织中甲基化水平有显著差异的CpG位点,经过分析我们挑选出10个差异显著的甲基化位点,然后采用亚硫酸盐处理后Sanger测序技术对20份肿瘤样本和80份正常样本进行验证这些甲基化位点的情况,最后发现基因CLEC14A上的一个甲基化位点和数据库数据分析结果一致,80份脱落细胞样本中没有检测到甲基化,而肿瘤样本中该基因位点全部甲基化,通过分析其RNA-Seq数据,该基因在肿瘤中的表达量相比正常组织的表达量显著下降,提示甲基化可能影响了该基因的功能,也说明该基因可能参与了宫颈癌的发生发展过程,但该基因未见在宫颈癌中有相关报道。为进一步评估该甲基化位点用于宫颈癌筛查识别高级别病变的价值,针对该特定甲基化位点,开发构建了基于通用引物的多重荧光PCR定量检测甲基化的体系,同时通过样本中甲基化DNA和未甲基化DNA的Ct值,计算甲基化DNA的含量,评估了其特异性、重复性等分析性能,其检测灵敏度达到5%,然后对比Sanger测序验证检测体系的准确性。最后收集62例低级别的病变(low grade SIL,LSIL)样本、51例高级别的病变(high grade SIL,HSIL)样本、20例肿瘤的样本和90例正常样本,用新建立的检测方法进行检测,计算每个样本的甲基化比例。正常样本、LSIL、HSIL和肿瘤样本中甲基化比例平均值为0.2%、4.6%、30.7%和47.8%,甲基化程度和宫颈癌的进展直接相关。接着我们用SPSS软件对数据进行ROC曲线分析,对宫颈癌和高级别以上病变(HSIL+)样本的灵敏度和特异性分别为100%,84.2%和84.5%和90.1%,AUC面积值分别为0.916和0.924。相比TCT和HPV检测,大大提高了检测的准确性,能有效减少临床过诊等问题。整个研究我们发现了一个新的宫颈癌相关的甲基化分子标志物,该基因的功能可能与宫颈癌的发生发展相关,对其用于宫颈癌筛查的初步评估显示了非常不错的应用前景,相比现有方法,能有效减少临床的过诊问题,也为研究宫颈癌的发生、发展提供了新的靶标。