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目的:高血压是一种严重危害人类健康的慢性疾病,随着年龄的增加发病趋势逐渐升高。盐敏感性高血压在高血压中所占比例高达50%,更容易引起心肌肥厚、心力衰竭、肾功能不全等严重后果。盐敏感性高血压的发病机制复杂,钠水代谢障碍是重要的机制之一。最新的研究发现,胃泌素不仅能够调节胃酸分泌,还对机体内肾脏钠氢交换体3(NHE3)等离子泵有重要的调节作用。肠道NHE3在机体钠吸收方面也具有重要的作用,通过抑制肠道NHE3限制机体对钠的摄入,可能是高血压治疗的一个新的方向和靶点。本研究通过化学方法将胃泌素连接到Si02微粒表面,使其在进入机体后,只作用于胃肠道的肠上皮细胞,而不被吸收进入机体,运用动物实验和细胞实验,从一个新的角度探索胃泌素在血压调节中的作用,同时也为其作为高血压的治疗的新靶点提供充分的证据。方法:动物实验一:使用Dahl盐敏感性大鼠和SS-13BN盐不敏感性大鼠,分别分为3组:对照组(0.4%NaCl)、高盐组(8%NaCl)、高盐+胃泌素处理组(8%NaCl+gastrin(0.2mg/kg/day))。每天同一时间使用尾袖法测量大鼠血压;使用代谢笼收集Dahl盐敏感性大鼠和SS-13BN盐耐受性大鼠不同组的大鼠的尿液,检测大鼠尿钠和尿肌酐的含量;通过质谱法检测大鼠体内是否含有合成胃泌素;免疫荧光共定位检测Dahl大鼠小肠刷状缘上胃泌素受体和NHE3是否发生间接或直接的作用;免疫荧光检测Dahl大鼠高盐喂养之后小肠刷状缘膜上NHE3的位置改变和高盐喂养的同时给予胃泌素灌胃对NHE3位置改变的作用;获取3组Dahl盐敏感性大鼠小肠绒毛刷状缘膜蛋白,使用western blot的方法检测小肠刷状缘膜上NHE3,NHERF1,NHERF2,NHERF3,ezrin和IRBIT的表达。动物实验二:制备胃泌素受体敲除小鼠(CCKBR-/-)和野生型小鼠(CCKBR+/+),分别分为两组:对照组(0.4%NaCl)和高盐组(6%NaCl),颈动脉插管法检测小鼠血压;使用代谢笼收集CCKB受体敲除小鼠(CCKBR-/-)和野生型小鼠(CCKBR+/+)对照组和高盐组的尿液,检测尿钠和尿肌酐的含量;使用western blot的方法检测CCKB受体敲除小鼠(CCKBR-/-)和野生型小鼠(CCKBR+/+)对照组和高盐组小肠刷状缘膜上NHE3,NHERF1,NHERF2,NHERF3,ezrin和IRBIT的蛋白表达。细胞实验:使用Caco-2细胞,分为5组:对照组、高盐组(高盐培养基(NaCl浓度提高50mM))、高盐+胃泌素组(高盐培养基+gastrin(1000nM))、PLC抑制剂组(高盐培养基+PLC抑制剂(10μM)+gastrin(1000nM))和PKC抑制剂组(高盐培养基+PKC抑制剂(10μM)+gastrin(1000nM)),高盐+胃泌素组的细胞先用胃泌素预处理1小时,然后高盐刺激;PLC抑制剂组先用PLC抑制剂(U73122)预处理1小时,再加入胃泌素预处理1小时,然后高盐刺激;PKC抑制剂组先用PKC抑制剂(Go6983)预处理1小时,再加入胃泌素预处理1小时,然后高盐刺激;使用western blot方法检测不同组 Caco-2 细胞膜蛋白上 NHE3,NHERF1,NHERF2,NHERF3,ezrin 和 IRBIT 的表达。结果:动物实验一:Dahl盐敏感性大鼠经过高盐喂养之后,血压显著高于对照组大鼠的血压,高盐+胃泌素处理组大鼠的血压相比于高盐组大鼠血压显著的降低(P<0.05);而SS-13BN盐耐受性大鼠各组之间的血压并无明显的差异;Dahl盐敏感性大鼠和SS-13BN盐耐受性大鼠高盐组的尿钠水平和对照组相比显著增加(P<0.05),但SS-13BN盐耐受性大鼠高盐组的尿钠排泄水平高于Dahl盐敏感性高血压大鼠高盐组;Dahl盐敏感性大鼠和SS-13BN盐耐受性大鼠高盐+胃泌素组的尿钠水平和两种大鼠的高盐组相比显著降低(P<0.05);免疫荧光共定位显示,在Dahl盐敏感性大鼠中NHE3和胃泌素受体共定位于小肠绒毛的刷状缘膜上;免疫荧光结果显示,Dahl盐敏感性高血压大鼠高盐组和对照组相比,NHE3向小肠绒毛刷状缘膜上转移增加,高盐+胃泌素组和高盐组相比,NHE3由小肠绒毛刷状缘膜向细胞内转移;Western blot结果显示,Dahl盐敏感性高血压大鼠高盐组和对照组相比,小肠绒毛刷状缘膜上NHE3,NHERF1,NHERF2,NHERF3,ezrin和IRBIT表达显著增加(P<0.05),给予胃泌素处理后,这些蛋白的表达量与高盐组相比显著减少(P<0.05)。动物实验二:胃泌素受体敲除小鼠(CCKBR-/-)对照组和野生型小鼠(CCKBR+/+)对照组相比收缩压显著升高,胃泌素受体敲除小鼠(CCKBR-/-)高盐组和野生型小鼠(CCKBR+/+)高盐组和各自的对照组相比,血压进一步升高,但胃泌素受体敲除小鼠(CCKBR-/-)高盐组血压高于野生型小鼠(CCKBR+/+)高盐组血压;胃泌素受体敲除小鼠(CCKBR-/-)对照组和野生型小鼠(CCKBR+/+)对照组相比,尿钠水平显著降低,胃泌素受体敲除小鼠(CCKBR-/-)高盐组和野生型小鼠(CCKBR+/+)高盐组相比,尿钠水平显著降低(P<0.05);胃泌素受体敲除小鼠(CCKBR-/-)对照组和野生型小鼠(CCKBR+/+)对照组相比,小肠绒毛刷状缘膜上NHE3,NHERF1,NHERF2,NHERF3,ezrin和IRBIT表达显著增加(P<0.05),高盐饮食之后这些蛋白的表达进一步增加。体外实验证实,Caco-2细胞高盐组和对照组相比细胞膜上NHE3,NHERF1,NHERF2,NHERF3,ezrin 和 IRBIT 表达显著增加(P<0.05),胃泌素能够显著阻断高盐引起的蛋白表达升高(P<0.05),而PLC和PKC抑制剂则能够显著减少组胃泌素引起的NHE3,NHERF1,NHERF2,NHERF3,ezrin和IRBIT的表达减少(P<0.05)。结论:胃泌素能够通过PLC/PKC途径,抑制NHE3,NHERF1,NHERF2,NHERF3,ezrin和IRBIT形成大分子复合物,从而促使小肠绒毛刷状缘膜上NHE3向细胞内转移,降低NHE3在小肠刷状缘膜上的表达,缓解高盐饮食引起的血压升高,可能成为高血压治疗的新靶点。目的:扩张型心肌病是一种严重的心肌病,其特征为心腔扩张和心脏收缩功能受损,伴或不伴有充血性心力衰竭。引起扩张型心肌病的因素很多,但是其发病机制目前还不清楚。我们的前期研究发现多巴胺D5受体敲除小鼠表现为心脏重量增加,心肌肥厚。这说明多巴胺D5受体与心肌病的发生发展具有密切的关系。因此本研究通过动物实验和细胞实验两方面研究多巴胺D5受体在扩张型心肌病发生发展过程中的具体作用机制。方法:制备心脏特异性表达人D5受体转基因的小鼠(hD5F173L-TG)和心脏特异性表达人D5正常受体转基因小鼠(hD5WT-TG);构建表达人多巴胺D5受体突变基因的H9c2细胞(H9c2-hD5F173L)和表达人多巴胺D5受体正常基因的H9c2细胞(H9c2-hD5WT);超声检测并比较hD5F173L-TG小鼠和hD5WT-TG小鼠的心脏功能并给予3月龄的hD5F173L-TG小鼠apocynin处理后观察心脏功能的改善;颈动脉插管法检测hD5F173L-TG小鼠和hD5WT-TG小鼠血压变化;使用光泽精方法检测小鼠心脏和转染人多巴胺D5受体的H9c2细胞中NADPH氧化酶活性;使用ELISA的方法检测转基因小鼠心脏和转染人多巴胺D5受体的H9c2细胞ROS的产量;Western blot检测小鼠心脏中P40phox、P47phox、Nrf2、Nrf2下游信号分子NQO1和HO1以及心脏损伤标志物PLN、SerCa2、BCL-2、BAX和信号通路分子p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-P38和P38的表达量以及apocynin处理后这些蛋白表达的变化,检测H9c2-hD5WT和 H9c2-hD5F173L细胞中 P40phox、P47phox、Nrf2、Nrf2 下游信号分子NQO1和HO1的表达;免疫荧光检测Nrf2、BAX、BCL-2和J-NK在H9c2-hD5WT和H9c2-hD5F173L细胞中表达变化,检测使用Nrf2抑制剂(ML385)后对BAX、BCL-2和JNK的表达的作用;免疫共沉淀检测3月龄和4月龄的hD5F173L-TG小鼠心脏Nrf2和泛素化蛋白的相互作用;Western blot检测H9c2-hD5WT H9c2-hD5F173L细胞中P40phox、Nrf2、p-ERK1/2和p-JNK的蛋白表达,以及使用PKA抑制剂(H89)和PKG抑制剂(KT5823)后蛋白表达的变化。结果:动物实验发现,与hD5WT-TG小鼠相比,hD5F173L-TG小鼠心脏的左室收缩末期和和舒张末期容积,左室收缩末期和舒张末期内径显著增大,射血分数和左室短轴缩短率显著降低,心脏重量明显增加,心肌发生明显的纤维化,但血压无显著性差异。给予apocynin处理之后,hD5F173L-TG小鼠心脏功能较未处理组得到了显著的改善。与hD5WT-TG小鼠相比,hD5F173L-TG小鼠心脏NADPH氧化酶活性和ROS产量显著增加,NADPH氧化酶的调节亚基P40phox和P47phox在细胞膜上表达显著增加,使用apocynin处理后hD5F173L-TG小鼠心脏NADPH氧化酶活性降低,细胞膜上P40phox和P47phox表达降低,但ROS产量降低程度低于NADPH氧化酶的降低程度。细胞实验我们发现,与H9c2-hD5WT细胞相比,H9c2-hD5F173L细胞NADPH氧化酶活性,ROS的产生以及P40phox和P47phox的基础表达量都明显增加。机制研究发现,hD5F173L-TG小鼠3月龄时Nrf2、NQO1和HO1表达轻度增加,但是在4月龄时表达显著降低,apocynin对这些蛋白的表达没有显著作用,且3月龄时Nrf2泛素化轻微降低,在4月龄时泛素化显著增加。在H9c2-hD5WT细胞中Nrf2主要表达在细胞浆,而在H9c2-hD5F173L细胞中Nrf2在细胞核中表达增多。hD5F173L-TG小鼠心脏 PLN、SerCa2、BAX 和 BCL-2 以及 p-JNK 和 p-ERK1/2 表达增加,使用 apocynin后表达显著降低。使用PKG抑制剂能够显著抑制H9c2-hD5F173L细胞中P40phox、p-JNK和pERK1/2的表达。结论:多巴胺D5受体通过抑制NADPH氧化酶活性,同时促进Nrf2转运入核表达抗氧化蛋白激活ERK/JNK通路,从而发挥抑制氧化应激的作用最终避免扩张性心肌病损伤。