研究背景和目的：因外伤、畸形、感染、肿瘤等导致的骨缺损是骨科临床的常见疾病,也是骨科医师和科研工作者面临的棘手问题。大段的骨缺损往往愈合缓慢或者难以自行愈合,严重时可能引起骨不连、假关节形成、二次骨折的发生甚至危及患者的生命。传统治疗骨缺损的方法有自体骨移植、同种异体骨移植和人工骨移植等。自体骨移植是目前骨缺损治疗的金标准。由于移植的骨组织取自患者自身,其具有理想的治疗效果,然而却存在来源有限、增加创伤和手术感染风险以及术后慢性疼痛等不足,限制了其广泛应用。同种异体骨移植采用不同个体的骨组织进行移植。由于移植的骨组织来自不同个体,移植后极有可能发生免疫排斥反应和传播潜在的疾病,导致移植失败、影响治疗效果。人工骨移植是利用合成的骨组织替代材料植入骨缺损部位进行填充修复,避免了自体骨移植和同种异体反应骨移植的缺点。1995年,Crane等学者提出了组织工程骨的理念,将细胞、活性因子或者药物与生物基质材料复合,制备人工骨组织,用于骨缺损的修复和治疗。近年来,材料学和医学的科研工作者利用组织工程技术进行组织工程骨的研究已取得飞速的发展。组织工程骨包括支架基质材料、成骨相关细胞、激活因子及力学性能四个要素。理想的组织工程骨应具备以下特点：(1)良好的生物相容性和可塑性,可即刻填充缺损部位而无毒性、炎症反应；(2)具有三维立体结构、合适孔径结构和孔隙率,从而有利于组织细胞的黏附和增殖,以及营养物质的渗入和代谢产物的排出；(3)具有一定的力学性能和良好的降解性能,植入后可在缺损部位提供即刻的支撑,基质材料降解后由新生组织逐渐修复和代替,最终完全取代组织工程骨：(4)骨传导和成骨诱导作用,植入后提供支架微环境,起引导和支持的作用,使周围有活性的干细胞、成骨相关细胞、血管肉芽组织长入,诱导未分化的间充质干细胞成骨分化,促进新骨生成和沉淀。传统的单一的基质材料如藻酸钙、羟基磷灰石等仅具备单相的生物学和材料学特性,难以满足复杂的要求,而将促进成骨效能的药物与具有缓释载药性能的载体材料结合,再与基质材料混合可制备出符合生物学和材料学要求的复合组织工程骨。聚乳酸-羟基乙酸聚合物(PLGA)由两种单体乳酸、羟基乙酸根据需求随意调整构成比例聚合而成,具有优异的生物相容性和载药性能,现已广泛应用于制药、医用材料和组织工程等领域。磷酸钙骨水泥(CPC)是一种临床应用广泛的具有良好生物相容性的骨修复材料,固化过程产热量极小,可保证搭载药物的药效和活性不受影响；具有可降解性,降解产物为羟基磷灰石(HA),与人类骨组织中的无机成分相同。辛伐他汀是他汀类药物,是HMG-CoA还原酶抑制剂,能阻断HMG-CoA转化为甲羟戊酸,常温下为白色粉末状物质,难溶于水而易溶于有机溶剂。临床上辛伐他汀广泛应用于降低血液胆固醇和低密度脂蛋白。然而,近年来研究发现,他汀类药物还具有促进成骨细胞的增殖和分化,抑制破骨细胞的活性,增加新生骨形成的作用。其作用机理包括：(1)可促进骨形态发生-2(BMP-2)的表达,继而促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化,刺激骨形成和矿化。Mundy等学者发现他汀类药物可激活BMP-2启动基因,促进其表达,其将他汀类药物局部注射于小鼠颅骨皮下组织中,发现局部注射部位新骨形成明显。(2)抑制基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的活性。MMP-9是基质金属蛋白酶家族成员,在诸如骨关节炎等骨组织改建导致的破坏性骨疾病的病理过程中起重要作用。Thunyakitoisal等学者研究发现辛伐他汀可减少成骨细胞和人成纤维肉瘤HT1080细胞的MMP-9的表达,并与剂量和作用时间相关,证实辛伐他汀可以通过抑制MMP-9来促进成骨反应和抑制破骨反应。(3)上调钙结合蛋白(Calcyclin)的表达。Hwang等学者通过对辛伐他汀刺激表达的蛋白进行定性分析发现,Calcyclin的表达上调显著,明显刺激成骨标志物碱性磷酸酶的mRNA增殖和表达。另外,辛伐他汀还可通过抑制破骨细胞活性、增强巨噬细胞等免疫细胞的功能等机制来促进骨修复。辛伐他汀的部分作用机理具有剂量相关性。但是,辛伐他汀口服的利用率较低,且有肝毒性和肌毒性。在大剂量长期服用时,其毒副作用更为明显。利用具有缓释载药性能的载体材料搭载辛伐他汀,制备成具有缓释性能和较高生物利用率的组织工程骨,可降低毒副作用的发生,在骨缺损局部最大限度的发挥药物效能。本实验采用水包油包固态物微乳液溶剂蒸发法(S/O/W)制备载辛伐他汀的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球,测量载辛伐他汀PLGA微球的粒径大小和分布、载药率和药物释放的规律；然后,将微球与磷酸钙骨水泥(CPC)复合构建载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙骨水泥组织工程骨,首先对其进行孔径大小和分布、孔隙率和抗压性能等材料学性质的研究；其次,体外提取、纯化、培养兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察该组织工程骨对兔骨髓间充质干细胞增殖及诱导成骨分化的能力,评估其体外生物相容性和成骨分化活性；最后,麻醉后手术构建兔股骨髁骨缺损的模型,将载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨植入股骨髁外侧骨缺损部位,通过影像学(Micro-CT)和组织学(HE染色)观察其动物体内生物相容性和成骨活性。本项研究的目的是制备载辛伐他汀的PLGA载药微球,并将其与磷酸钙骨水泥复合后构建组织工程骨,测定其材料学性质,评价其体外和动物体内生物相容性和成骨活性,探讨其对兔股骨髁骨缺损的修复效果。本实验的创新点在于首次采用PLGA微球作为缓释载体,成功构建了可缓释辛伐他汀的组织工程骨,有望为骨缺损的修复治疗提供一种新途径。本项研究分为三部分：(1)载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨的制备和材料学性质研究；(2)载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨的生物相容性和成骨分化活性的体外研究；(3)载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨的生物相容性和促进兔股骨髁骨缺损愈合的动物体内研究。现将本实验的主要内容介绍如下。第一部分载辛伐他汀PLGA磷酸钙组织工程骨的制备和材料学性质研究方法：运用水包油包固态物微乳液溶剂蒸发法(S/O/W)制备单纯PLGA微球、搭载辛伐他汀的PLGA载药微球。通过扫描电镜(SEM)观察单纯PLGA微球、搭载辛伐他汀的PLGA载药微球的微观形态,测量微球粒径的大小和分布；将搭载辛伐他汀的PLGA载药微球置于缓冲溶液中,通过酶标仪测定其载药和缓释性能。分别将单纯PLGA微球、搭载辛伐他汀的PLGA载药微球与磷酸钙骨水泥混合、固化制备出单纯PLGA/磷酸钙组织工程骨和载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨。通过扫描电镜(SEM)观察单纯PLGA/磷酸钙组织工程骨和载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨的微观结构；通过Micro-CT扫描检测两种组织工程骨的孔径大小、分布以及孔隙率；采用万用测试仪检测两种组织工程骨的抗压强度即力学性能。结果：运用水包油包固态物微乳液溶剂蒸发法(S/O/W)成功制备出粒径约221.89±70.20μm的单纯PLGA微球和粒径约217.95±63.37μm的载辛伐他汀的PLGA载药微球,两种微球的外观、粒径大小和分布无显著差异。载辛伐他汀PLGA微球的载药率为85.30±4.3%,在前7天可缓释约60%的药量,并可缓慢释放辛伐他汀约21天。单纯PLGA/磷酸钙组织工程骨和载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨均具有良好的三维孔隙结构。单纯PLGA/磷酸钙组织工程骨的孔隙率约为64.50±4.27%,孔径约为234.65±65.36gm,抗压强度约为6.34±1.41Mp；载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨的孔隙率约为65.95±3.30%,孔径约为225.74±57.02μm,抗压强度约为6.52±1.73Mp。两种组织工程骨的孔隙率、孔径和抗压强度无显著差异。结论：1.运用水包油包固态物微乳液溶剂蒸发法(S/O/W)可成功制备出符合材料学要求的载药PLGA微球。2.PLGA微球可作为辛伐他汀的载体和缓释体。随着载药微球的降解,可使辛伐他汀产生突释效应且缓慢释放达21天。3.载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨具有优异的药物缓释性能、良好的三维连通性、合适的孔隙孔径结构和抗压性能。第二部分载辛伐他汀PLGA磷酸钙组织工程骨的生物相容性和成骨分化活性的体外研究方法：过量麻醉后取1月龄新西兰大白兔的股骨和胫骨,Ficoll密度梯度离心法提取原代兔骨髓间充质干细胞,体外培养、传代,采用倒置显微镜观察细胞的形态。流式细胞仪鉴定后,将生长状态良好的第四代兔骨髓间充质干细胞分别接种于单纯PLGA/磷酸钙组织工程骨和载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨。培养7天后,运用扫描电镜观察接种细胞的形态;运用CCK-8活细胞计数法检测接种细胞的黏附和增殖情况；运用流式细胞周期检测组织工程骨对于接种细胞的周期影响；对接种细胞进行碱性磷酸酶活性测定和茜素红S染色以评估组织工程骨的成骨分化活性。结果：单纯PLGA/磷酸钙组织工程骨和载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨均对骨髓间充质干细胞有着良好的生物相容性,而后者表现出更强的成骨分化活性。两种组织工程骨均与细胞粘附性良好,接种于载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨的细胞形态呈多角状,且细胞的数量更多。相对于单纯PLGA/磷酸钙组织工程骨组和空白对照组,载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨组的细胞增殖、处于细胞分裂期的细胞数、碱性磷酸酶活性以及茜素红S染色阳性的矿化结节数目和范围均明显增高(P<0.05)。结论：Ficoll密度梯度离心联合贴壁培养法可分离、培养出纯度较高的兔骨髓间充质干细胞。体外细胞实验显示载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨具有良好的生物相容性和成骨分化活性,其缓释的辛伐他汀可促进兔骨髓间充质干细胞的增殖并诱导其成骨分化。第三部分载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨的生物相容性和促进兔股骨髁骨缺损愈合的动物体内研究方法：建立新西兰大白兔单侧股骨髁骨缺损模型30只(6周龄,雌雄各半,体重约1.0kg;山东大学实验动物中心提供,许可编号；SYXK2013-0001),按照随机原则分为A、B、C三组,每组10只。A组为空白对照组,即假手术组,仅建立股骨髁骨缺损；B组为单纯PLGA/磷酸钙组织工程骨组,将单纯PLGA/磷酸钙组织工程骨植入骨缺损部位；C组载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨组,将载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨植入骨缺损部位。于术后6、12周时通过大体观察、Micro-CT扫描(二维扫描分析和三维重建)和病理组织切片观察,评估骨缺损的愈合情况,并分析各组骨缺损的愈合程度有无显著差异。结果：植入组织工程骨后6周和12周时,载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨组的骨缺损修复的速度和质量均显著优于空白对照组和单纯PLGA/磷酸钙组织工程骨组。标本大体观察：术后6周和12周时,C组骨缺损的愈合情况均要优于A组和B组。Micro-CT扫描分析：C组骨覆盖率(Bone Coverage)于6周和12周时分别为25.78±6.89%和68.06±11.62%,骨密度值(Bone Mineral Density)于6周和12周时分别为90.92±9.85 mg/cm3和201.98±12.23 mg/cm3,显著优于A组(骨覆盖率：6周时3.40±2.25%,12周时6.10±4.48%；骨密度值：6周时31.04±5.75 mg/cm3,12周时52.80±8.84 mg/cm3)和B组(骨覆盖率：6周时12.89±5.75%,12周时29.24±9.25%；骨密度值：6周时59.28±5.75 mg/cm3,12周时52.08±10.78 mg/cm3)。Micro-CT三维重建：C组股骨髁骨缺损愈合的速度和质量均显著高于A组和B组,12周时骨缺损处已经完全愈合,和周围骨组织无明显界限。A组骨缺损处未见明显愈合,12周时仍有大块缺损；B组骨缺损处见部分愈合,12周时仍然遗留部分缺损。组织学检查(HE染色)：C组骨小梁及骨基质的形成速度和质量均优于A组和B组,可见大量新骨生成,骨小梁的厚度与正常骨组织近似。A组骨缺损处少见新生骨小梁,由大量的纤维细胞填充。B组骨缺损处可见部分新生较纤细的骨小梁和少量的纤维细胞填充。结论：动物体内实验显示载辛伐他汀/PLGA/磷酸钙组织工程骨具有良好的生物相容性和促进成骨作用,可提高骨缺损修复的速度和质量。