胚胎着床是胎生哺乳动物及人类生殖的重要环节,胚胎着床的关键步骤是胚胎滋养层细胞对子宫内膜的侵入。滋养层细胞与子宫内膜上皮细胞和基质细胞之间的“对话”精确地调节滋养层细胞的增殖分化和子宫内膜的蜕膜化。蜕膜是子宫内膜基质受蜕膜化诱导因子的刺激而增殖和再分化形成的一种特殊组织,它对妊娠的建立和维持至关重要。在小鼠,胚胎粘附诱导上皮下基质细胞增殖、分化为成熟的蜕膜细胞,并逐渐向周围扩展,形成的蜕膜细胞又依照同样的方向不断退化和死亡,并被邻近的滋养层细胞或巨噬细胞吞噬。蜕膜细胞的增殖和退化同时并存,二者在动态平衡中协调蜕膜细胞的数量和滋养层细胞的侵入。现已表明,蜕膜细胞的增殖与退化是一个涉及多种因素的细胞凋亡过程。鉴于该过程与肿瘤侵袭过程的相似性,其涉及的调控机制也是目前生殖领域研究的热点。在诸多参与细胞凋亡的因子中,肿瘤坏死因子TNF是诱导细胞凋亡的一类重要的细胞因子,TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)作为其家族成员是近几年肿瘤预防和治疗领域的研究热点之一。本实验室在前期的小鼠子宫免疫组化时发现,TRAIL在植入前的子宫上皮及植入后蜕膜细胞的表达呈现出很强的时空特异性,并且此期间TRAIL特异的凋亡受体MK(Mouse Killer)的表达也呈相互配合的趋势,这提示TRAIL信号可能与小鼠植入后蜕膜细胞的凋亡有密切关系,可能参与了妊娠小鼠子宫内膜蜕膜化的进程。基于前期试验结果,本试验采用基因工程技术、细胞原代培养、Western blotting、免疫细胞化学、流式细胞术、荧光定量PCR以及宫角注射等方法初步探讨TRAIL对妊娠小鼠子宫内膜蜕膜化进程的作用及其分子机理。该研究将为阐明胚胎着床的分子机理补充新的证据,同时也为胚胎植入与肿瘤侵袭的比较研究提供新的视野。第一部分TRAIL在小鼠子宫蜕膜细胞中的表达目的:筛选分离提取小鼠子宫内膜基质细胞的最佳方法,了解原代培养的小鼠子宫内膜基质细胞的生长特性,分析基质细胞诱导蜕膜化之后TRAIL mRNA及蛋白的表达情况。方法:胰酶消化法和混合酶消化法分离提取并培养妊娠小鼠子宫内膜基质细胞,采用细胞免疫荧光技术检测波形蛋白的表达对其纯度进行鉴定,通过检测细胞贴壁率找出基质细胞生长所需的最适pH,采用MTT试验绘制生长曲线,找到其对数生长期,最后用孕酮、雌二醇和cAMP诱导基质细胞蜕膜化,RT-PCR和Western blotting分别检测不同时间点TRAIL mRNA及蛋白的表达。结果:1.相对于混合酶消化法,胰酶消化法成本低,省时省力,且提取培养的原代妊娠小鼠子宫内膜基质细胞数量多,纯度较高,达到(95.8±0.3)%;2.基质细胞生长的最适pH值为7.0,原代培养12-48h为其对数生长期,48h后即进入平台期;3.小鼠子宫基质细胞在诱导蜕膜化后,TRAIL mRNA及蛋白的表达随时间增长而显著升高(p<0.05)。结论:成功筛选出高效可行、简单实用的基质细胞原代培养方法,并初步了解基质细胞的生长特性,同时对基质细胞进行蜕膜化诱导后,发现TRAIL在蜕膜化过程中有特异的表达变化。第二部分卵巢激素对小鼠子宫中TRAIL基因表达的调控目的:探讨孕酮、雌二醇是否对TRAIL基因在小鼠子宫的表达具有调控作用。方法:将去卵巢小鼠随机分为4组,每组3只:1.孕酮组,0.2mg/mouse;2.雌二醇组,100ng/mouse;3.孕酮+雌二醇组,剂量同前;4.对照组,芝麻油0.1ml/mouse。分别于皮下注射后0h、6h、12h、24h取各组小鼠子宫,采用荧光定量PCR对TRAIL mRNA的水平进行检测,同时用Western blotting检测其蛋白表达水平的变化。结果:孕酮和雌二醇均能显著提高TRAIL mRNA和蛋白在小鼠子宫中的表达,且表现为时间依赖性,随时间增长TRAIL mRNA和蛋白的表达显著增加(p<0.05),孕酮和雌二醇联合使用时,调控作用有一定的叠加效应(p<0.05)。结论:TRAIL基因在小鼠子宫中的表达受到孕酮、雌二醇的正向调节。第三部分TRAIL对小鼠子宫内膜蜕膜化进程的功能研究第一节TRAIL过表达质粒的构建目的:构建TRAIL过表达质粒,为研究TRAIL基因的功能提供工具。方法:通过设计两条分别带有SalI和MluI酶切位点的PCR引物,将TRAIL的全长cDNA序列作为目的序列克隆入pSEB-HUS载体,即pSEB-HUS-TRAIL。通过菌液PCR检测、SalI和MluI双酶切鉴定和测序验证质粒构建是否正确。菌液Western blotting检测pSEB-HUS-TRAIL在菌液中是否表达TRAIL蛋白。结果:成功构建TRAIL基因的过表达质粒pSEB-HUS-TRAIL。第二节TRAIL干扰质粒的构建目的:构建、筛选针对TRAIL基因的干扰质粒,为后续试验做准备。方法:设计、合成4条靶向TRAIL基因的干扰序列,将干扰序列克隆到SfiI酶切后的pSEB-HUS-TRAIL质粒中,转化DH5α后进行菌液PCR和质粒测序,分别命名为SipSEB-TRAIL1、SipSEB-TRAIL2、SipSEB-TRAIL3、SipSEB-TRAIL4。将4个干扰质粒分别转染HEK-293细胞,选择72h后GFP荧光最弱的干扰质粒用PacI酶切除去TRAIL基因后自连,即为筛选出的TRAIL干扰质粒。结果:成功构建、筛选出SipSEB-TRAIL3为TRAIL基因干扰质粒。第三节TRAIL对小鼠子宫内膜蜕膜化进程的影响目的:观察过表达及干扰TRAIL对小鼠子宫内膜蜕膜基质细胞增殖、细胞周期、凋亡及蜕膜化进程的影响,以及对在体蜕膜化进程的影响。方法:TRAIL过表达或干扰质粒转染小鼠基质细胞后诱导蜕膜化发生,于转染后72h时,通过RT-PCR及Western blotting评价其转染TRAIL过表达及干扰质粒后增强或抑制TRAIL表达的效应。通过MTT法观察蜕膜基质细胞的生长和增殖能力,流式细胞术检测蜕膜基质细胞的细胞周期分布和凋亡率,Western blotting检测催乳素蛋白表达的变化情况。过表达和干扰质粒转染293细胞后收集逆转录病毒并测定滴度。通过宫角注射分别给予妊娠d3.5小鼠TRAIL过表达和干扰逆转录病毒,d7和d8时取蜕膜组织进行称重,同时统计植入点数目。结果:TRAIL过表达质粒能够上调蜕膜基质细胞中TRAIL mRNA及蛋白的表达,干扰质粒能有效地抑制TRAIL mRNA及蛋白的表达(p<0.05)。在体外,TRAIL过表达使蜕膜基质细胞被阻滞在G0/G1期、抑制蜕膜基质细胞增殖并促使其凋亡,催乳素表达降低,而干扰TRAIL促进蜕膜细胞的增殖,减少了蜕膜细胞的凋亡,催乳素表达升高。体内宫角注射逆转录病毒,过表达TRAIL使蜕膜组织重量降低,干扰TRAIL使蜕膜组织重量增加,过表达和干扰TRAIL后小鼠子宫植入位点均显著减少。结论:过表达TRAIL抑制妊娠小鼠子宫内膜的蜕膜化进程,干扰TRAIL促进妊娠小鼠子宫内膜的蜕膜化进程,但二者均造成植入胚胎数量的下降,其原因可能是破坏了子宫内膜蜕膜基质细胞增殖与凋亡的平衡。第四节TRAIL影响小鼠子宫内膜蜕膜化进程的分子机理目的:初步探讨TRAIL影响妊娠小鼠子宫内膜蜕膜化进程的分子机理。方法:RT-PCR检测妊娠小鼠子宫内膜基质细胞诱导蜕膜化后,TRAIL受体DcR1、DcR2和MK的mRNA表达。基质细胞转染TRAIL过表达质粒后诱导其蜕膜化,Western blotting检测pro-caspase-8及Bcl-2的蛋白的表达。结果:DcR1 mRNA在诱导基质蜕膜化72h升高显著(p<0.05),DcR2 mRNA随时间变化不显著(p>0.05),MK mRNA的表达随诱导蜕膜化时间的增长而显著升高,且表达量在24h时达到高峰(p<0.05)。基质细胞转染TRAIL过表达质粒72h后的pro-caspase-8及Bcl-2蛋白水平显著降低(p<0.05)。结论:蜕膜基质细胞中TRAIL过表达会引起细胞凋亡水平提高,相反,干扰TRAIL表达使细胞凋亡水平降低,推测小鼠子宫蜕膜细胞中TRAIL主要通过与膜受体MK结合引起pro-caspase-8活化为caspase-8,同时下调Bcl-2表达而通过线粒体依赖途径诱导蜕膜基质细胞的凋亡。综上所述,本试验证明了TRAIL在小鼠蜕膜基质细胞蜕膜化过程中具有特异的表达,且受到孕酮和雌二醇的正调节,TRAIL具有促进蜕膜基质细胞凋亡、抑制子宫内膜蜕膜化进程的功效,推测其主要通过与膜受体MK结合引起pro-caspase-8活化为caspase-8,同时下调Bcl-2表达,通过线粒体依赖途径诱导蜕膜基质细胞的凋亡。